SPEKTROSKOPIA NMR W BADANIACH STRUKTURALNYCH KWASÓW NUKLEINOWYCH CZĘSC I 55
O OH O P O
O CH t NM O P O H
Rysunek 3 A) Schemat intra- i internukIeotydo\v>ch połączeń NOE obserwowanych w regionie H6/H8-H1 ’ widma 2D NOESY Fragment widma 2D NOESY dla dupleksu RNA o sekwencji pokazanej na rysunku B) Sekwencyjna ścieżka NOE H6/H8-HP dla gomej mci zaznaczona jest limą
przerywaną, dla dolnej nici linią ciągłą
Największątrudnościąw przypisaniu sygnałów rezonansowych cząsteczek RNA jest identyfikacja sygnałów protonów rybozy H2’, H3\ H4’ H5’ i H5” Dzieje się tak dlatego, gdyż wszystkie te sygnały występują w bardzo wąskim zakresie od 3.75 do 5 ppm. Nakładanie się sygnałów dla reszt cukrowych w RNA jest znacznie silniejsze niz w DNA. W widmach cząsteczek DNA sygnały pochodzące od sygnałów H2’ i H2” przesunięte są w stronę niższych częstości (2-3 ppm).
W celu przypisania sygnałów pochodzących od protonów pierścieni cukrowych analizę widm zaczyna się od znalezienia korelacji pomiędzy protonami HI’- H2’. Wicynalne stałe sprzężenia Hl’-H2’ dla form C2'-endo (-8-10 Hz) i C3'-endo (< 2 Hz) różnią się znacznie. Dlatego tez dla cząsteczek helikalnych struktur typu A-RNA, charakteryzujących się konformacjąCT-endo reszt tybozy, sygnały korelacyjne pomiędzy protonami Hl’-H2’ są na ogół bardzo trudne do zaobserwowania w konwencjonalnych widmach TOCSY i COSY. Odległość pomiędzy protonami Hl’-H2’ niewiele zmienia się w zależności od konformacji lybozy i wynosi 2,8-3,0A. Dla większości typowych konformerów lybozy pozostałe protony znajdująsię wduzo większej odległości, dlatego tezsygnały pochodzące od protonów H2’ można przypisać na podstawie widm 2D NOESY wykonanych z krótkim czasem mieszania, gdzie w regionie cukrowym, sygnały HI ’-H2’ pojawiająsię jako najsilniejsze. Jeśli jest to możliwe, pozostałe sygnały reszt lybozy H3’/H47H5’ i H5” przypisuje się na podstawie eksperymentów DQF-COSY i TOCSY, wykorzystując stałe sprzężenia H2’-H3’ i H3’-H4’ oraz korelacje pomiędzy H4’ i protonami H57H5”. Niezwykle pomocne do identyfikacji oraz potwierdzenia przypisań sygnałów rybozy (H37H47 H5\ H5”) są widma korelacyjne 'H -3IP. Dla większości konformacji szkieletu fos-forocukrowego możliwa jest obserwacja sekwencyjnych połączeń pomiędzy proto-