3870137279

SPEKTROSKOPIA NMR W BADANIACH STRUKTURALNYCH KWASÓW NUKLEINOWYCH CZĘSC I 63

szym, jak dotychczas, medium wydaje się być bakteriofag Pfl, który zachowuje swoje porządkujące właściwości w szerokim zakresie temperatur.

Resztkowe stałe sprzężenia dipolowego można mierzyć dla dowolnej pary jąder aktywnych magnetycznie, które wykazująmierzalne oddziaływania dipolowe. W białkach informację o sprzężeniach dipolowych uzyskuje się na ogół dla wiązań amidowych 'H—^I5N w próbkach znakowanych izotopem ^,5N. Uwzględnienie resztkowych sprzężeń RDC w obliczeniach strukturalnych białek nie tylko wpływa na znaczną poprawę dokładności badanej struktury, ale w niektórych przypadkach możliwe jest nawet wyznaczenie struktury cząsteczki de novo bez znajomości więzów opartych o oddziaływania NOE i sprzężenia skalarne. Włączanie więzów RDC w proces udo-kładniania struktury staje się już rutyną w przypadku białek, i być może stanie się wkrótce rutyną dla kwasów nukleinowych.

Dla cząsteczek RNĄ, znakowanie izotopem ¹⁵N dostarcza jedynie ograniczonej liczby sprzężeń dipolowych ‘H-^I5N. Czasami jednak znajomość nawet niewielkiej liczby tych sprzężeń może prowadzić do uzyskania cennych informacji. Na przykład znajomość jedynie 25 sprzężeń dipolowych ‘H-¹⁵N dla protonów iminowych była wystarczająca aby pokazać, że kąt pomiędzy ramieniem akceptorowym a trzonem antykodonu w cząsteczce tRNA^VaI jest podobny do tego, jaki zaobserwowano w strukturze krystalicznej dla tRNA^Phe [59]. Na ogół jednak, w celu uzyskania dostatecznej liczby więzów kierunkowych w kwasach nukleinowych, konieczne jest zastosowanie znakowania izotopowego ^l3C.

W przypadku kanonicznej struktury dupleksu DNA ustalono, uwzględniając wyjątkowo dużą liczbę więzów, a w szczególności więzów kierunkowych uzyskanych z pomiaru resztkowych stałych sprzężenia dipolowego (^l3C-'H, ¹³C-¹³C, 'H-'H), detale strukturalne porównywalne z tymi, jakie można otrzymać na podstawie analizy rentgenowskiej [60]. Zaobserwowane niewielkie różnice pomiędzy strukturą krystaliczną a otrzymaną w roztworze wskazują na to, że siły upakowanie w krysztale mogą indukować zmiany strukturalne.

PODSUMOWANIE

Jeszcze kilka lat temu wydawało się, że został osiągnięty kres możliwości dla wyznaczania struktur kwasów nukleinowych w roztworze metodami spektroskopii NMR. Nawet rozwój technik pozwalających na całkowite i selektywne znakowanie izotopowe (¹⁵N, ^I3C i ²H) w połączeniu z rozkwitem coraz doskonalszych technik eksperymentalnych wielowymiarowej, heterojądrowej spektroskopii NMR pozwalał na ustalanie struktur kwasów nukleinowych nie większych niż 15 kDa, mimo że dla białek granicę tę przekroczono już dużo wcześniej. Dopiero w roku 2003 pokazano, że jest to możliwe również dla cząsteczek RN A, ustalając strukturę przestrzenną domeny II HCV IRES [61] składającej się z 77 reszt nukleotydowych (25 kDa). Rekord ten nie trwał długo, gdyż już kilka miesięcy później opublikowana została struktura cząsteczki RNA wirusa MLV o długości 101 reszt nukleotydowych [62].