3870137255

SPEKTROSKOPIA NMR W BADANIACH STRUKTUR.VLNYCH KWASÓW NUKLEINOWYCH CZ.ĘSC I 51

W niniejszym artykule przedstawione zostanąjedynie problemy dotyczące dostępnych obecnie sposobów otrzymywania kwasów nukleinowych na potrzeby spektroskopii NMR oraz strategie przypisywania sygnałów w widmach cząsteczek zarówno o naturalnej zawartości izotopów jak i całkowicie znakowanych ^l3C i/lub ^,5N. Pokrótce omówione zostaną także ostatnie osiągnięcia w metodologii dła multijądro-wej spektroskopii NMR, które stanowią źródło nowych jakościowo informacji.

Zagadnienia doty czące otrzymywania więzów strukturalnych oraz metod obliczeniowych stosowanych w celu ustalenia struktur kwasów nukleinowych metodami NMR będą przedmiotem odrębnej pracy (część II).

1. SYNTEZA RNA I DNA

Niewątpliwą zaletą spektroskopii NMR jest jej unikalna zdolność pozwalająca na określanie struktury biomolekuł w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. Eksperymenty NMR wymagają dostępu do miligramowych ilości materiału o bardzo wysokiej czystości. W przypadku badań prowadzonych dla cząsteczek o większej masie konieczne jest posiadanie preparatów całkowicie, częściowo lub/i selektywnie znakowanych izotopami ¹³C i ^I5N. Obecnie na potrzeby badań NMR stosuje się dwie różne strategie otrzymywania fragmentów kwasów nukleinowych o określonej sekwencji. Są to: chemiczna synteza na podłożu stałym w oparciu o metodę fosforyno-amidow'ą oraz synteza enzymatyczna m vitro.

Chemiczna synteza oligonukleotydów, stosowana standardowo od lat 80. ubiegłego stulecia [8] jest procesem cy klicznym składającym się z kilku etapów, w efekcie którego po każdym cyklu przyłączana jest kolejna reszta nukleotydowu Ze względu na zawadę przestrzenną grupy ochronnej funkcji hydroksylowej 2’-OH, wy dajność jednego cyklu syntezy RNA jest znacznie niższa (96-97%) niż syntezy DNA (98-99%). Ogranicza to dostęp do fragmentów RNA o długości około 30 reszt nu-klcotydowych.

Idea enzymatycznej syntezy RNA na potrzeby NMR jest stosunkowo prosta [9, 10J i stosuje się ją rutynowo w wiciu laboratoriach 111-13]. Opiera się ona o reakcję transkrypcji m vitro na syntetycznych matrycach DNA, przy udziale poli-merazy T7 z wykorzystaniem rybonukleozydo-5’-trifosforanów (rNTP). Izotopowe znakowane rNTP otrzymuje się zazwyczaj z komórek E. coh hodow'anych na pożywkach zawierających Jako źródło węgla i azotu, wyłącznie izotopy ¹³C i/lub ¹⁵N. Wyizolowany z komórek RN A jest hydrolizowany do rybonukleozydo-5 ’-monofos-foranów, a następnie pożądane rNTP otrzymuje się w procesie enzymatycznej fosforylacji nukleozydomonofosforanów NMP. Wadą enzymatycznej metody syntezy oli-goiybonukleoty dów jest warunek narzucany na minimalną długość syntety zowanego łańcucha (kilkanaście reszt nukleotydowych).

Otrzymanie na drodze syntezy' enzymatycznej znakowanych izotopowo cząsteczek DNA o określonej sekwencji na potrzeby spektroskopii NMR jest znacznie trudniejsze. Do niedawna większość eksperymentów hetcrojądrowych dla DNA wyko-