6161619714

5.3. Spektroskopia w podczerwieni w badaniach struktury i stabilności białek

Spektroskopia w podczerwieni jest jedną z najbardziej wszechstronnych technik badawczych, pozwalających na obserwowanie struktury drugorzędowej białek oraz jej zmian wywołanych różnymi czynnikami zewnętrznymi. Jej niewątpliwą zaletą jest możliwość dostosowania warunków pomiarowych do konkretnego problemu. Dostępnych jest wiele odmian tej techniki (np. tradycyjna spektroskopia transmisyjna, spektroskopia ATR lub spektroskopia odbiciowa), umożliwiających pomiary roztworów białek o różnym stężeniu, żeli, cienkich filmów lub stałych preparatów.

Popularnym problemem biochemicznym do którego wykorzystuje się spektroskopię FTIR jest analiza struktury drugorzędowej białek. Rozwój tej techniki eksperymentalnej w badaniach biochemicznych spowodowany jest wzrostem zainteresowania strukturą białek oraz ograniczeniami bardziej bezpośrednich technik, takich jak NMR i krystalografia rentgenowska. Wprawdzie za pomocą spektroskopii w podczerwieni nie można uzyskać informacji o absolutnej strukturze białka, to jednak, w przeciwieństwie do wymienionych wyżej technik, pozwala ona na analizę struktury białek trudno rozpuszczalnych, nie tworzących kryształu lub białek o masach cząsteczkowych powyżej kilkudziesięciu kDa.

Spektroskopia w podczerwieni jest także wykorzystywana w badaniach nad stabilnością białek, nad mechanizmem ich denaturacji oraz do badania molekularnych podstaw ich funkcjonowania. Na Rys. 3 przedstawiono przykładową serię widm FTIR lizozymu z białka jaja kurzego zmierzonych w różnych temperaturach (rozpuszczalnikiem była woda ciężka). Zmiany w kształcie pasm można powiązać ze zmianami w strukturze drugorzędowej białka, pojawiającymi się wraz ze wzrostem temperatury. Na podstawie zależności wartości absorbancji przy liczbie falowej 1640 cm'¹ od temperatury możliwe jest wykreślenie krzywej denaturacji (we wstawce), która może posłużyć do określenie temperatury denaturacji lub pomóc w określeniu mechanizmu denaturacji białka.

Rys. 3. Seria widm lizozymu z białka jaja kurzego zmierzonych w zakresie temperatur 30,4°C - 83,5°C. Strzałkami oznaczono kierunek najważniejszych zmian w natężeniu i położeniu pasm amidowych I’ oraz II, towarzyszących wzrostowi temperatury. Widma zmierzono w kuwecie transmisyjnej wyposażonej w okienka z CaF₂ rozdzielone przekładkami teflonowymi o grubości 56 pm. Temperatura była regulowana za pomocą zewnętrznego kontrolera. We wstawce przedstawiono krzywą denaturacji, wyznaczoną dla liczby falowej 1640 cm'¹.

Wykorzystanie spektroskopii różnicowej lub czasowo rozdzielczej spektrofotometrii (ang. time-resolved) z wykorzystaniem techniki zatrzymanego przepływu pozwala