08

a jeżeli mają różne potencjały lub jednego z wgięć brak, proces jest nieodwracalny. Położenie wgięć na krzywej oscylopolarograficznej zależy od natury depolaryzatora. Potencjał szczytu wgięcia praktycznie zgadza się z półfalą potencjału w klasycznej polarografii, a jego wielkość lub głębokość jest funkcją stężenia depolaryzatora. W pomiarach analitycznych preferuje się pomiar odległości między szczytem wgięcia a potencjałem osi.

Stwierdzono oscylopolarograficzną aktywność wszystkich puryn i pirymidyn, występujących w kwasach nukleinowych. Aktywne oscypolarograficznie okazały się również kwasy nukleinowe, zarówno RNA, jak i DNA. Palećek (1960 1964) wykazał oscylopolarograficzną aktywność wysoko spolimeryzowanego DNA, zarówno natywnego, jak i /denaturowanego. Te pierwsze badania stały się podstawą dalszych dociekań, które wykazały, że metody oscylopolarograficzne znajdują zastosowanie w badaniu wielu interesujących zagadnień dotyczących DNA, a więc denaturacji, replikacji, niejednorodności cząsteczki DNA. Metody oscylopolarograficzne dostarczają również informacji o strukturze DNA. Cząsteczki DNA powodują powstawanie oscylopolarogramu o charakterystycznym przebiegu. Na rysunku 10.7 przedstawiono przebieg krzywej dEfdt = /(£) dla DNA w środowisku mrówczanu amonu o pH 7. Natywny DNA wykazuje wgięcic w anodowej części krzywej, zdenaturowa-ny DNA lub DNA częściowo tylko zdenaturowany daje natomiast głębsze wgięcie w części anodowej i nowe wgięcie w katodowej części krzywej.

Aby poprawnie interpretować wyniki otrzymane dla wielkocząsteczkowych kwasów nukleinowych, należało poznać mechanizm reakcji elektrodowych poszczególnych składników- DNA. Aktywne oścylopolarograficznie są wprawdzie wszystkie puryny i pirymidyny wchodzące w skład DNA, ale tylko cytozyna i guanina oraz ich pochodne nukleotydy i nukleozydy reagują w obojętnym środowisku, w którym bada się cząsteczki DNA. Adenina daje wgięcie w katodowej części krzywej dEjdt = /(£), ale jedynie w środowisku kwasowym, a tymina również w katodowej, lecz w pH zasadowym, np. w 1 M roztworze NaOH.

Cytozyna cechuje się wgięciem w części katodowej w środowisku o pH^7. Badania polarograficzne wykazały, że wgięcie to ma charakter redukcyjny i jest również charakterystyczne dla 5'-metylocytozyny oraz 5'-hydroksymetylocytozyny, a także dla ich nukleozydów i nukleotydów.

Badania polarograficzne i oscylopolarograficzne cząsteczek guaniny i jej związków udowodniły, że w środowisku mrówczanu amonu o pH 7 powoduje ona wgięcie anodowe krzywej dEjdt = /(£). Jego głębokość zależy od temperatury (wraz ze wzrostem temperatury zmniejsza się). Zmiany, jakim ulega guanina. to prawdopodobnie utlenianie.

Zmiany anodowe wytwarzane przez DNA na krzywe| oscylopolarograficzne) dEjdt - f[E).

Za występowanie wcięcia anodowego na krzywej dEjdt = /(£) otrzymywanej dla roztworów DNA, jak wynika z powyżej przedstawionych badań, jest odpowiedzialna reszta guaniny. Wgięcie to otrzymuje się analizując DNA zarówno natywny, jak i zdenaturowany, ale w tym drugim przypadku pogłębia się ono wyraźnie (rys. 10.7). Jego głębokość zależy od stężenia mrówczanu amonu i od pH, przy czym maksimum przypada w pH 6,4 6,9.

t08