01

czeń ilościowych oraz jakościowych złożonych mieszanin związków chemicznych, do kilkudziesięciu związków w mieszaninie (por. podrozdz. 4.8.3). Podstawową cecha odróżniającą HPLC od klasycznej chromatografii kolumnowej jest bardzo mała wielkość ziaren nośnika chromatograficznego wypełniającego kolumnę chromatograficzną (zazwyczaj 3-10 pm). Im mniejsze są ziarna nośnika chromatograficznego, tym większa powierzchnia czynna, z którą mogą oddziaływać chromatog-rafowane związki i tym większa rozdzielczość chromatografii. Tak silne rozdrobnienie nośnika chromatograficznego powoduje jednak, że eluent z wielką trudnością penetruje kolumnę chromatograficzną i trzeba go pompować pod dużym ciśnieniem, by zapewnić odpowiedni przepływ eluentu względem nośnika chromatograficznego. Stąd też, nieodzownym elementem każdego zestawu w'ysokosprawnej chromatografii cieczowej (zwanej również wysokociśnieniową) jest pompa tłocząca eluent pod ciśnieniem do 350 atm (35 MPa). Pompa taka utrzymuje z wielką dokładnością żądaną szybkość przepływu eluentu przez kolumnę, co jest absolutnie niezbędne do zapewnienia powtarzalności rozdziałów chromatograficznych. Rozmiary typowych kolumn analitycznych stosowanych w HPLC wahają się w granicach 15-30 cm długości oraz 1 4,6 mm średnicy wewnętrznej i są wykonane ze stali nierdzewnej. Eluent doprowadza się do kolumny z pompy za pomocą cienkich kapilar stalowych lub plastikowych o średnicy wewnętrznej nie przekraczającej 0,5 mm. Kolejnym nieodzownym elementem zestawu jest dozownik prób (injector), który pozwala wstrzykiwać do kolumny analizowaną mieszaninę bez przerywania przepływu eluentu przez kolumnę. Typowe objętości próbek nastrzykiwanych na kolumnę analityczną wahają się w granicach 5-100 pl. Rodzaj nośnika chromatograficznego oraz skład eluentu dobiera się tak, aby wszystkie związki analizowanej mieszaniny uległy rozdziałowi w trakcie wędrówki przez kolumnę chromatograficzną i aby opuściły ją w jak najkrótszym czasie (nie więcej niż 60 min). Do wykrywania obecności i szacowania ilości poszczególnych związków eluowanych z kolumny służą różnego rodzaju detektory, z których najpopularniejszy jest detektor absorpcji promieniowania ultrafioletowego (detektor UV). Wykrywa on z dużą czułością wszystkie zasady azotowe, które wchodzą w skład kwasów nukleinowych, oraz ich pochodne, ponieważ związki te silnie pochłaniają nadfiolet. Detektor taki jest w istocie spektrofotometrem z przepływową kuwetą, do której wprowadza się kapilarą wyciek z kolumny chromatograficznej. Absorbancja wycieku przy zadanej długości fali jest mierzona ęrzfiz detektor w sposób ciągły i obrazowana na ekranie komputera wyposażonego w odpowiednie oprogramowanie chromatograficzne (w starszych chromatografach funkcję tę pełnił rejestrator, kreślący krzywą na papierze milimetrowym).

Kreślona w ten sposób krzywa zależności absorbancji od czasu zwana jest chromatogramem. W momencie, gdy w wycieku z kolumny pojawia się związek pochłaniający ultrafiolet, krzywa ta przybiera kształt szczytu (peak) chromatograficznego, a pole powierzchni pod powstałym szczytem jest wprost proporcjonalne do ilości związku, który go wywołał. Operacja pomiaru pola powierzchni pod szczytami chromatogramu określana jest jako integracja chromatogramu. W celu ilościowego oznaczenia jakiegoś związku w nieznanej mieszaninie za pomocą HPLC trzeba mieć czysty wzorzec tegoż związku, przygotować jego roztwory kalibracyjne

421