etapie obydwa typy komórek mają zabarwienie granatowe.
Płukanie w alkoholu powoduje, że w komórkach Gram-dodatnich następuje \ zmniejszenie pustej przestrzeni w wielowarstwowych ścianach komórkowych, mających wygląd wielu (ok. 50) nałożonych na siebie siatek. W rezultacie kompleksy fioletu krystalicznego z jodem nie mogą ulec wypłukaniu, co w przypadku 1-2 warstw u bakterii Gram-ujemnych nie jest przeszkodą i alkohol Świetnie wypłukuje barwnik. Możliwe też że kompleks fiolet-jod łączy się trwale z kompleksem rybonukleinianu magnezu i zasadowego białka które są obecne w ścianie bakterii Gram-dodatnich w dużych ilościach lub że bardziej ujemnie naładowana (inny punkt izoelektryczny) ściana Gram-dodatnich silniej wiąże zasadowy fiolet.
Po zakończonym płukaniu komórki Gram-dodatnie są granatowe, zaś Gram-uiemne - bezbarwne.