20080421036

ĆWICZENIE II

lemat: Hngerprinting DNA: Analiza Southern Biot

Cel:

Celem ćwiczenia jest poznanie metody hybrydyzacyjnej analizy kwasów nukleinowych na przykładzie metody Southern Biot.

Wymagana wiedza:

Hybrydyzacyjne metody analizy DNA i RNA Enzymy restrykcyjne w biologii molekularnej Zmienność DNA

Ćwiczenie wykonujemy w rękawiczkach. Unikać dotykania membrany i bibuły filtracyjnej gołymi rękoma!!!

Wykonanie ćwiczenia:

Elektroforeza w żelu agarozowym

1.    Przygotować 100 ml 0,8% roztworu agarozy w ix stężonym buforze do elektroforezy (roztwór wyjściowy jest 50x stężony).

2.    Roztwór ostudzić do temperatury ok. 55°C.

3.    Żel wylać na saneczki i uformować kieszonki przy pomocy grzebienia.

4.    Żel pozostawić do zastygnięcia na ok. 20 min.

5.    Zalać żel 2 L lx stężonego buforu do elektroforezy (wyjściowy roztwór jest 50x stężony).

6.    Wyjąć grzebienie.

7.    Nałożyć do kieszonek 35-40 pl odpowiednich próbek DNA wg wzoru:

Pierwszy rząd:

DNA standardowy DNA matki cięte enzymem 1 DNA matki cięte enzymem 2 DNA dziecka cięte enzymem 1 DNA dziecka cięte enzymem 2

1    A

2    B

3    C

4    D

5    E

Drugi rząd:

1    A

2    F

3    G

4    H

5    I

DNA standardowy DNA ojca I cięte enzymem 1 DNA ojca I cięte enzymem 2 DNA ojca II cięte enzymem 1 DNA ojca II cięte enzymem 2

8.    Elektroforezę prowadzić ok. 1,5 h przy napięciu 70 V.

9.    Po zakończeniu elektroforezy naciąć prawy górny róg żelu.

10.    Wybarwić żel w bromku ety dyny (ok. 10 minut). Obejrzeć w świetle UV.

11.    Zamieścić na kartce opis każdej kieszonki oraz zidentyfikować odpowiednie pasma na

żelu.

12.    Przepłukać żel w wodzie destylowanej.