biol4

•    przykryć szkiełko nakrywkowe szkiełkiem przedmiotowym Lindnera, tak by kropla zawiesiny znalazła się na środku wgłębienia;

•    lekko docisnąć szkiełko i odwrócić preparat tak, aby kropla zawiesiny swobodnie zwisała wewnątrz wgłębienia.

3.3. Technika barwienia drobnoustrojów

3.3.1. Proces i cel barwienia

Drobnoustroje charakteryzuje słaba zdolność załamywania światła, dlatego, aby ułatwić ich obserwacje, w przeważającej większości przypadków ogląda się je pod mikroskopem w preparatach barwionych.

Barwienie drobnoustrojów jest procesem fizykochemicznym, polegającym na wniknięciu barwnika do wnętrza komórki i utworzeniu barwnego kompleksu z cytoplazmą. Do barwienia drobnoustrojów stosuje się najczęściej zasadowe barwniki anilinowe, ponieważ wykazują one powinowactwo z plazmą komórkową, charakteryzującą się kwaśnym odczynem. Do tych barwników należą: błękit metylenowy, fiolet krystaliczny, goryczkowy i metylowy, fuksyna zasadowa, zieleń malachitowa. Do barwników kwaśnych, rzadziej używanych przy sporządzaniu preparatów mikrobiologicznych, należą: fuksyna kwaśna, eozyna, erytrozyna, nigrozyna. Niektóre barwniki stosuje się z dodatkiem tzw. zapraw (jodu, fenolu), ułatwiających zatrzymywanie ich w komórce. Zapraw dodaje się przed barwieniem lub w jego trakcie. Barwienie ma na celu:

•    odróżnienie drobnoustrojów od otoczenia,

•    różnicowanie morfologiczne poszczególnych komórek drobnoustrojów,

•    zaobserwowanie pewnych szczegółów w budowie komórki,

•    wykazanie zmian czynnościowych w komórce.

3.3.2. Podział barwień

Barwienia dzielimy na:

•    proste, czyli jednobarwne (monochromatyczne) - polega na barwieniu jednym barwnikiem. Może być ono:

-    pozytywne - barwi się komórkę (błękitem metylenowym) metodą Lófflera,

-    negatywne - barwi się tło nigrozyną (w tej metodzie nie utrwala się preparatu);

•    złożone, czyli wielobarwne (polichromatyczne) - stosuje się dwa lub więcej barwników według ściśle określonej kolejności, np. metodami Grama i Wiirtza:

- barwienia pozytywno-negatywne - komórka i tło barwią się na różne kolory, np. metodą Burri-Giusa.

Wyróżnia się także barwienie przyżyciowe, kiedy na nieutrwalony preparat z żywą zawiesiną drobnoustrojów działa się barwnikiem w dużym rozcieńczeniu, np. barwienie komórek drożdży przy oznaczaniu ich żywotności. Celem tego barwienia jest przeważnie odróżnienie komórek żywych od martwych. Zabarwieniu ulegają komórki martwe, w których została uszkodzona błona komórkowa, a komórki żywe pozostają bezbarwne. Do barwienia najczęściej stosuje się błękit metylenowy w rozcieńczeniu 1: 10 000.

3.3.3. Sporządzanie preparatów barwionych

Barwienie preparatów utrwalonych obejmuje trzy etapy i wymaga:

•    wykonania rozmazu,

•    utrwalenia preparatu,

•    zabarwienia preparatów.

Rozmaz. Sporządza się go na szkiełku przedmiotowym, z naniesionego na nie materiału, jak przy wykonywaniu preparatu wilgotnego, p^ .ługując się ezą. Następnie rozmaz należy wysuszyć w powietrzu atmosferycznym.

Utrwalanie preparatu. Stosuje się w celu zabicia drobnoustrojów i przytwierdzenia ich do szkiełka podstawowego. Można przeprowadzać je metodą termiczną lub chemiczną.

Metoda termiczna. Polega na trzykrotnym powolnym przeciągnięciu szkiełka przedmiotowego z wysuszonym rozmazem w płomieniu palnika. Szkiełko należy trzymać szczypcami Cornetta, zwrócone rozmazem do góry.

Metoda chemiczna. Polega na zalaniu wysuszonego rozmazu odpowiednim związkiem chemicznym (alkoholem, eterem, formaliną) i pozostawieniu go na kilka minut. Po wyschnięciu preparat można barwić wybraną metodą.

Barwienie proste, pozytywne metodą Lfflera. Metoda polega na wybarwieniu komórek (w utrwalonym preparacie) błękitem metylenowym przez 5 min. Następnie preparat należy spłukać wodą i wysuszyć. Komórki obserwowane pod mikroskopem mają zabarwienie niebieskie. Ten sposób barwienia jest bardzo często stosowany w mikrobiologii.

Barwienie proste, negatywne. Metoda polega na uzyskaniu kontrastu między ciemnym tłem a nie wybarwionymi komórkami. Do barwienia negatywnego najczęściej używa się barwników gruboziarnistych, jak: tusz chiński, nigrozyna. Barwnik dodajemy do zawiesiny na szkiełku i mieszamy. Następnie drugim szkiełkiem robimy rozmaz (rys. 3.2). Preparat suszymy (nie utrwalamy) i oglądamy pod mikroskopem.

Barwienie złożone, negatywno-pozytywne. Jest kombinacją barwienia negatywnego i pozytywnego. Zasada tego barwienia polega na stosowaniu jednego z wymienionych przy metodzie negatywnej barwników

29