img074 7

.    u/.iiMM umieszcza się w komorze trawiącej Ricordiego, przez którą

przepływa roztwór enzymów trawiennych. W miarę postępującego procesu trawienia wyspy trzustkowe uwalniane są od otaczającej je tkanki egzokrynnej, komórki przechodzą przez sito znajdujące się w komorze i krążą wraz / roztworem enzymów trawiennych (ryc. 9.3). W czasie procesu trawienia pobierane są próbki w celu mikroskopowej oceny liczby wolnych wysp trzustkowych. Analizę mikroskopową przeprowadza się po barwieniu'dTtizonen który łącząc się z cynkiem insuliny barwi wyspy trzustkowe na kolor ezerwon; Po otrzymaniu większości wolnych wysp trzustkowych proces trawienia enzymatycznego zostaje zatrzymywany przez dodanie medium rozcieńczającego oraz albuminy surowicy krwi ludzkiej. Zawiesinę wysp trzustkowych wiruje się i oczyszcza od komórek egzokrynnych w gradientach ficolu. Na podstawie liczby i wielkości oblicza się wskaźnik równoważności wysp trzustkowych (Islct Equivalent - TEQ). Jeden IEQ odpowiada wyspie trzustkowej o średnicy 150 (im.

Ryc. 9.3. Schemat przedstawiający proces izolacji wysp trzustkowych wg C. Ricordiego (2005).

Komora trawiąca Ricordiego (A), termometr (U), wytrząsarka (C), obwód podgrzewający roztwór enzymów trawiennych (D), pompa (E). cylinder łączący przewody w czasie procesu izolacji (F), butelka z medium rozcieńczającym (G), kolba z albuminą surowicy krwi ludzkiej, w której zbierany jest roztwór z komórkami po zakończonym procesie trawienia enzymatycznego (H), punkt pobierania próbek krążącego płynu (I), (zgoda C. Ricordiego na zamieszczenie ryciny)

(	■%
JN

Ryc. 9.4. Wysepki trzustkowe wybarwione ditizonem po oczyszczeniu w gradiencie ficolu (pow.

J00x) - fot. M. Pokrywczyńska

Przed przeszczepem wskazana jest hodowla wysp trzustkowych przez 24-48h celem polepszenia wydajności produkcji insuliny oraz żywotności wysp trzustkowych.

Warunki przeszczepiania wysp trzustkowych: minimum 6000 DEQ o czystości >30% i żywotności wysp >70%, indeksie stymulacji glukozą >1 oraz poziomie endotoksyn < 5 EU/kg m.c. biorcy. Wyklucza się obecność bakterii tlenowych oraz beztlenowych, grzybów i mykoplazm w zawiesinie wysp trzustkowych.

Czystość wysp trzustkowych ocenia się po barwieniu ditizonem, poprzez odniesienie liczby wysp trzustkowych do liczby komórek tkanki egzokrynnej. Żywotność wysp trzustkowych ocenia się barwieniem jodkiem propidyny i diacetonem fluoresceiny. Indeks stymulacji glukozą wyznacza się za pomocą tzw. statystycznego testu inkubacji z glukozą. W celu wyznaczenia indeksu stymulacji glukozą wyspy trzustkowe inkubuje się w roztworze o niskim (2,8 mM) oraz wysokim stężeniu glukozy (25 mM). Indeks stymulacji glukozą jest to stosunek ilości insuliny wydzielonej przez wyspy trzustkowe w roztworze o wysokim stężeniu glukozy do ilości insuliny wydzielonej przez wyspy

123