img085 2

Substancjo polurm* s;i dobr/c rozpuszcza Ine w ro/pim/t /nimi .n li polarnych (woda, niższe alkoh słabo rozpuszczają się w rozpuszczalnikach niopolarnych (juk cykloheksan czy CC1₄).

Substancje nicpolarnc (np. węglowodory) łatwo rozpuszczają się w rozpuszczalnikach nicpoląrn natomiast trudno w polarnych. Rozpuszczalność substancji w jednej i w drugiej fazie ma decyduj! wpływ na stosunek podziału między te dwie fazy.

4.4.2. Chromatografia podziałowa kolumnowa

Kolumnowa chromatografia podziałowa ze względu na rodzaj stosowanych faz dzi się na: chromatografię w układzie ciecz ciecz oraz chromatografię w układzie ciec/

W pierwszym przypadku fazę ruchomą i nieruchomą stanowią dwie niemieszające się sobą ciecze, w drugim fazą ruchomą jest gaz. Pierwszy rodzaj chromatogi znajduje zastosowanie do rozdziału substancji rozpuszczających się w obydwu cieczą drugi do rozdziału mieszaniny gazów lub par, które przepuszczone przez kolumt / nieruchomą fazą ciekłą rozdzielają się wskutek selektywnej adsorpcji.

Nośniki ciekłej fazy nieruchomej oraz solwenty. Pożądane jest, aby nośnik ciekły fazy nieruchomej i¹, wykazywał właściwości adsorpcyjnych, nic wchodził w reakcję z solwcntcm (fazą ruchomą) ani z subs' cj.imi rozdzielanymi, a jednocześnie wiązał i zatrzymywał fazę nieruchomą (do kilkudziesięciu procent 11, na masę nośnika). Wodę można niekiedy zastąpić innymi cieczami polarnymi, których cząsteczki zaw¹ grupy hydroksylowe. W rzeczywistości nic spotyka się nośników, które by całkowicie spełniały wymion postulaty. Z nośników zatrzymujących fazę wodną zadowalające właściwości wykazują: żel krzemionko ziemia okrzemkowa, skrobia i miazga celulozowa. Jako nośniki o właściwościach hydrofobowych zatrzymywania cieczy niepolarnych znalazły zastosowanie kauczuk wulkanizowany i chlorokauczuk.

Fazę ruchomą w chromatografii podziałowej stanowią przeważnie następujące rozpuszczalnik chloroform, alkohol butylowy i amylowy, kwas izomasłowy, pirydyna, kolidyna, chinolina, k Niekiedy znacznie lepsze wyniki rozdziału uzyskuje się używając rozpuszczalników mieszanych. Naj v.ą metodą rozwijania chromatogramu jest wymywanie. W przypadku nośnika z osadzoną na nim ci najc/ęścicj wodą, i przemywania kolumny solwentem, najczęściej nicpolarnym (nie mieszającym i z polarną fazą nieruchomą), można mówić o technice zwanej chromatografią podziałową fazy normaI

Stosując nośniki hydrofobowe można użyć nicpolarnego solwentu organicznego jako fazy nieruch mej, a wody lub roztworu wodnego jako fazy ruchomej. Sposób ten nosi nazwę: chromatografia f» odwróconej. Zmieniając fazę ruchomą na nieruchomą i odwrotnie powoduje się równocześnie /nr; kolejności w ułożeniu pasm poszczególnych składników na kolumnie, co niekiedy jest korzystne uzyskania dobrego rozdziału.

Zastosowanie chromatografii podziałowej kolumnowej ogranicza się tylko do tych substancji, kl wykazują umiarkowaną rozpuszczalność w wodzie, używanej najczęściej w charakterze fazy nicrucho: Jako metoda analityczna ma mniejsze znaczenie niż chromatografia podziałowa na bibule oraz chro tografia jonowymienna.

4.4.3. Chromatografia podziałowa bibułowa

Swój wczesny rozwój i rozpowszechnienie chromatografia podziałowa bibułowa zawdzięcza: 1) prostocie techniki, aparatury oraz sprzętu, 2) możliwości rozdzielaniu i wykrywania składników mieszanin, których odseparowanie dotychczas stosowanymi metodami było zbyt żmudne i długotrwałe oraz 3) możliwości przeprowadzaniu mikroanaliz.

In Imika chromatografii bibułowej polega na zanurzeniu w pojemniku z lO/piuzc/nlnlkicm organicznym końca bibuły znajdującego się bliżej linii startu z na kroplom) mieszaniną składników Całość umieszcza mv w komorze nasyconej parami wody i rozpuszczalnika. Rozpus/czalnlk wsiąka w bibułę dzięki jej knpilamości. a także własnej sile ciężkości. Różne substancje ułożone w punkcie startu przemieszczają się wiitz z rozpuszczalnikiem z szybkością zależną od ich współczynnika podziału między rozpuszczalnikiem organicznym a wodą nasycającą bibułę. Na ogół przepływ należy zatrzymać, gdy rozpuszczalnik dociera •lo przeciwnego końca bibuły. Bibułę suszy się w temperaturze pokojowej lub w suszarce. Pozycje 10zdzielonych substancji wykrywa się za pomocą odczynników.

W chromatografii bibułowej nośnikiem fazy stacjonarnej (najczęściej polarnej) jest odpowiednio •preparowana bibuła filtracyjna (czysta celuloza). Z uwagi na kierunek migracji fazy ruchomej w bibule wyróżnia się chromatografię jednowymiarową i dwuwymiarową, a ze względu na kształt bibuły chromatografię arkuszową, paskową oraz krążkową.

miiula chromatograficzna — ogólne właściwości. Jakość bibuły, jej czystość i jednorodność decydują • • wynikach analizy chromatograficznej. Wbrew pierwotnym przypuszczeniom bibuła bierze czynny ud/iuł w procesie rozdzielania. Fazę ruchomą stanowi nie czysta woda. lecz kompleks celuloza H.O. Ilibula jest zbudowana z włókien celulozowych ułożonych w porowatą, żelowatą strukturę. Cząs-loczki H₂0 zaadsorbowanc na bibule łączą się z włóknami celulozy wiązaniami wodorowymi. Do lo/dziclania większości znanych substancji zarówno organicznych, jak i nieorganicznych najbardziej nadają się bibuły Whatman. Szczególnie uniwersalne znaczenie ma bibuła Whatman nr 1 (średnio szybki przepływ).

Skład chemiczny bibuły Whatman: celuloza (98 99%), pentozany (0,4-0,8%). organiczne substancje to/puszczalnc w eterze (0,015 0.050%), amoniak (0.001 0,008%), składniki mineralne (0,01 0.07%). Ilibuły o szybkim przepływie adsorbują 180% H₂0. a o wolnym przepływie 115% H,0.

Do niektórych celów stosuje się w analizie chromatograficznej bibuły impregnowanetakimi substanc-Mmi jak: I) roztwory buforowe lub soli obojętnych, 2) rozpuszczalniki organiczne silnie polarne albo •labo polarne, 3) adsorbenty nieorganiczne (Si0₂, Al₂0₃), żywice jonowymienne (karboksylowane. •uHunowanc), 4) czynniki zmieniające chemicznie celulozę, np. w celulozę karboksylowaną czy acetylowa-iii) Większość tych czynników modyfikuje bibułę chromatograficzną w ten sposób, że procesem dominu-lącym nic jest podział solutu, lecz adsorpcja lub wymiana jonowa. (Stosowaną najczęściej impregnację lilbuły roztworami buforowymi przeprowadza się następująco: arkusz bibuły zrasza się roztworem buforu, układa się na kilku arkuszach bibuły zwykłej, przyciska bibułę aż do usunięcia nadmiaru płynu. I’i» wyschnięciu bibuła jest gotowa do użytku).

Kondycjonowanie bibuły. Jest to przygotowanie bibuły do procesu chromatograficznego; polega ono na nasyceniu jej parami rozpuszczalników przez kilka godzin w szczelnym pomieszczeniu (w komorze nasyconej parami rozpuszczalnika stosowanego do rozwijania chromatogramu) przez okres nie krótszy iii/ 30 min. Kondycjonowanie bibuły ponad 2 godz. jest zbyteczne.

Nanoszenie roztworu badanego na bibułę. Ilość substancji analizowanej zależy od czułości reakcji wywołującej Na ogół wprowadza się 1 50 pg badanej substancji w I plamic. Zastosowanie izotopów i techniki niitoradiograficzncj zmniejszyło do tysięcznych części pg ilość substancji potrzebnej do analizy. Substan-i |o obce zawarte w roztworze badanym wpływają ujemnie na rozdział chromatograficzny.

Jakość rozwiniętego chromatogramu zależy w dużej mierze od techniki nałożenia badanego roztworu. Na linii startu, nakreślonej ołówkiem, nanosi się mikropipetką niewielką objętość (2 20 pl) loztworu badanego jako okrągłą plamę o średnicy nic przekraczającej 3 4 mm lub bardzo wąską plamę liniową długości 1 1,5 cm, susząc je natychmiast powietrzem chłodnym lub ciepłym z suszarki fryzjerskiej. Obowiązuje zasada: każdą następną kroplę roztworu badanego wprowadza się wyłącznic po bardzo dokładnym wysuszeniu poprzedniej kropli w danej plamic. Odległość między plamami około 3 cm.

Odległość linii startu od brzegu arkusza bibuły w chromatografii jednokierunkowej zstępującej wynosi 6 9 cm, w chromatografii wstępującej zaś 3 cm. w chromatografii krążkowej punkt startu znajduje się w odległości 1 cm od środka krążka, a w chromatografii dwuwymiarowej zstępującej na przecięciu dwóch linii przeprowadzonych w odległości 6 9 cm równolegle od dłuższego i krótszego brzegu bibuły chromatograficznej. Należy dodać, że w większości przypadków szybkość przepływu

115