img100 2

4.6.3. Technika pracy na żelach Sephadex

Przygotowanie żelu. Aby uzyskać odpowiedni;} szybkość wycieku oraz zadowalając} rozdział substancji, trzeba przygotować żel szczególnie starannie. Suchy SephadcJt] powinien spęcznieć, co uzyskuje się przez zalanie go nadmiarem rozpuszczalnik; Pęcznienie można przeprowadzić w temperaturze pokojowej lub znacznie krócej w< wrzącej łaźni wodnej (tab. 4.10). Dokonanie pęcznienia w temp. 100°C ma równi* tę zaletę, że eliminuje jednocześnie nadmiar powietrza, który może powodować powstawanie w kolumnie pęcherzyków powietrza.

Tabela 4.10. Czas pęcznienia różnych żeli Sephadex

Typ żelu	Minimalny czas pęcznienia
	25 C	100 C
G-10, G-15, G-25, G-50	3 godz.	1 godz.
G-75	24 godz.	3 godz.
G-100, G-150. G-200	3 dni	5 godz.
LH-20	3 godz.	—

Przygotowanie kolumny. Po dostatecznym spęcznieniu żelu i zdekantowaniu trudi osadzających się i zbyt małych ziaren usunąć nadmiar wody lub innego stosował go rozpuszczalnika tak, aby powstała jednorodna zawiesina dająca się jesi przelewać. Zawiesinę tę jednorazowo wlać do przygotowanej szklanej kolumny chromatograficznej. W czasie tego zabiegu kran kolumny pozostaje zamknięty, a kiedy osadzający się żel utworzy warstwę około 5 cm, należy kran otworzyć. P< osadzeniu się całości żelu i utworzeniu kolumny wymaganej wielkości, kran trzel zamknąć i odsyfonować nadmiar roztworu, pozostawiając jednak nad żelem war* stwę 1 2 cm. W żadnym wypadku nie powinno się dopuścić do całkowitego wycieku roztworu z kolumny i zapowietrzenia złoża żelowego. W takim przypadki

powtórzyć przygotowanie kolumny.

Przez uformowane złoże przed użyciem go do rozdziału należy przepuśi 2 3-krotną objętość odpowiedniego roztworu ze zbiornika szczelnie połączonej z kolumną szklaną (pod ciśnieniem, jakie będzie stosowane w trakcie rozdział w celu uzyskania zrównoważenia i upakowania złoża kolumny.

Nanoszenie próbek i elucja. Sposób nanoszenia próbek podyktowany jest na ogi rodzajem użytego żelu. Stosując żele Sephadex od G-10 do G-50 wystarczy usui nadmiar eluentu z kolumny. Próbkę nakłada się ostrożnie na odsłoniętą powierzchni* żelu, stosując pipety o małym przekroju. Unika się w ten sposób wzburzania powierzchni słupa żelowego. Po nałożeniu próbki otwiera się kran i pozwala jej wsiąkną* pod ciśnieniem grawitacyjnym. Następnie kolumnę szklaną łączy się szczelnie zbiornikiem zawierającym stosowny eluent i po ustaleniu żądanej szybkości wycieku rozpoczyna się proces rozdzielczy. Objętość próbki nanoszonej w przypadku frak* jonowania powinna wynosić ok. 2% całkowitej objętości kolumny. W procesie odsalania ta objętość może być większa i wynosić około 25% całkowitej objętości kolumny.

Stosując żel Sephadex od G-75 do G-200, szczególnie do m/d/iclcnia białek, nic należy przed naniesieniem próbki usuwać eluentu /nad żelu, ule pozostawić jego slup ok. 3 cm. Próbę badaną wówczas podwarstwia się. W celu zwiększenia jej gęstości dodaje się do niej glukozy lub sacharozy.

Przed rozpoczęciem właściwej chromatografii filtracyjnej ważne jest sprawdzenie prawidłowego upakowania złoża żelu. Osiąga się to przepuszczając przez kolumnę barwną substancję wielkocząsteczkową, np. błękit dekstranowy lub hemoglobinę (dla żeli od G-10 do G-50). Jeżeli złoże żelowe jest prawidłowo ułożone, to substancja barwna wypływa w postaci regularnego i nierozmytego pasma.

Dobór wysokości uformowanego słupa żelu zależy od rodzaju rozdzielanych substancji. Aby uzyskać zadowalający rozdział, stosunek przekroju kolumny do jej wysokości powinien być mały. Do celów rozdzielczych stosuje się więc kolumny wysokie i długie. Do odsalania i rozdziałów preparatywnych można posługiwać się kolumnami o większej średnicy i mniejszej wysokości.

Po ukończonym frakcjonowaniu kolumnę można przygotować do następnych rozdziałów, bez przepakowania złoża żelowego, przepuszczając przez nią eluent w ilości odpowiadającej 2-3-krotnej objętości V_r Ewentualne zanieczyszczenia /andsorbowane na żelu można usunąć przemywając złoże 0,1% roztworem NaOH w temp. 20°C lub roztworem detergentu. Jeśli pozostawia się kolumnę na dłuższy i/as w stanie nieużywanym, należy zastosować środki konserwujące żel. Osiąga się to za pomocą eluentów nasyconych chloroformem lub n-butanolem. Można użyć także 0,02% roztwór azydku sodu lub przechowywać żel w 50% etanolu.

Ćwiczenie 4.17. Zastosowanie techniki filtracji żelowej do odsalania i frakcjonowaniu (Course in Gel Filtration. Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala 1970)

Materiał: Roztwór badany (w 0,9% NaCI) zawierający błękit dekstranowy 2000 (2 mg/ml), cyto-< lirom c (3 mg/ml) i K₂CrO_d (2 mg/ml).

I )(K/> uniki:

1)    0,9% roztwór NaCI.

2)    Sephadcx G-50 lub G-75.

Wykonanie: Z zawiesiny żelu Sephadex G-50 lub G-75 w 0,9% roztworze NaCI (nupęczniałego uprzednio w H₂0 przez 24 godz.) uformować złoże o wymiarach I x40 cm. Przez kolumnę przepuścić około 100 ml 0,9% roztworu NaCI. Następnie /amknąć wylot kolumny, odsyfonować warstwę roztworu znad żelu, powierzchnię żelu nakryć krążkiem bibuły i zaznaczyć wysokość słupa żelu. Na kolumnę wprowadzić 1 ml roztworu zawierającego błękit dekstranowy, cytochrom c i K₂Cr0₄. Podstawić probówkę, otworzyć kran kolumny szklanej i po wsiąknięciu w żel naniesionej próbki zmyć ścianki kolumny za pomocą 1 ml 0,9% roztworu NaCI. Następnie połączyć szczelnie kolumnę ze zbiornikiem zawierającym 0,9% roztwór NaCI i prowadzić elucję tym roztworem z szybkością ok. 1 ml/min, zbierając frakcje po 4 ml. Kontynuować zbieranie frakcji aż do pełnego wyeluowania KCr0₄. I Jsunąć żel z kolumny i zmierzyć za pomocą wody objętość całkowitą kolumny V_r /mierzyć absorbancję frakcji zawierających błękit dekstranowy przy A = 620 nm, a frakcji zawierających cytochrom c i K₂CrQ₄ przy A = 410 nm. Przeliczyć wartości

145