img152

9.3.4. Przechowywanie czystych kultur

Hodowle drobnoustrojów należy przechowywać w warunkach utrzymujących je w pełnej żywotności i nie mających wpływu na zmiany ich cech charakterystycznych, zarówno morfologicznych, fizjologicznych, jak i biochemicznych. Na zmiany tych cech wpływają bezpośrednio nagromadzające się produkty przemiany materii, zmiany wilgotności i dostępu tlenu oraz ilość dostępnych substancji odżywczych. Hodowle zazwyczaj przechowuje się w chłodniach, w temp. ok. 4°C, bez dostępu światła. Niska temperatura hamuje dalszy rozwój drobnoustrojów, ale procesy enzymatyczne i biochemiczne, choć spowolnione, zachodzą dalej, powodując stopniową degenerację komórek. Ważne jest więc zachowanie regularności w przeszczepianiu drobnoustrojów na nowe pożywki. Hodowle płynne przeszczepia się co najmniej raz na tydzień, hodowle na pożywkach stałych - raz na 2-3 tygodnie lub raz na miesiąc. Metodą, która pozwala na wieloletnie przechowywanie szczepów, jest tzw. liofilizacja.

Liofilizacja polega na wysuszeniu w próżni zamrożonych komórek drobnoustrojów. Stwierdzono, że przy szybkim obniżeniu temperatury do -70°C woda w komórkach bakterii zamarza w formie drobnych kryształków, nie naruszając struktur komórkowych (przy powolnym zamrażaniu powstające duże kryształy lodu niszczą błonę komórkową). Komórki zostają wysuszone przez sublimację wody w niskich temperaturach, dzięki czemu procesy biochemiczne zostają natychmiast zahamowane. Białko nie ulega jednak denaturacji, a układy enzymatyczne są w stanie niezmienionym. Najczęściej kultury do liofilizacji zawiesza się w mleku odtłuszczonym, umieszczając je w fiolkach szklanych. Aby ożywić liofilizowane kultury, do ampułek zakorkowanych jałową watą, natychmiast po otwarciu (w celu uniknięcia zakażenia z powietrza), dodaje się kilka kropli wody jałowej, bulionu lub roztworu soli fizjologicznej. Ampułki umieszcza się w termostacie na 30-60 minut. Należy pamiętać, by w tym czasie kilkakrotnie wymieszać ich zawartość. Do szczepów przechowywanych w ten sposób należą bardzo często bakterie z rodzajów Lactobacillus i Bifidobacterium.

Wykonanie ćwiczenia Metody hodowli drobnoustrojów

•    Materiały: hodowle bakterii tlenowych na pożywce bulionowej oraz na podłożu stałym, tzw. skosie, hodowle bakterii beztlenowych na skosie, woda jeziorowa.

•    Aparatura i szkło: jałowe pipety o pojemności 1 cm³, jałowe płytki Petriego.

•    Sprzęt: ezy i igły bakteriologiczne.

•    Odczynniki: 20% kwas pyrogallolowy, nasycony roztwór węglanu wapnia lub sodu.

76