img168 2

bakterii metodą FM polega na przesączeniu przez filtr membranowy, umieszczony w aparacie do filtracji (rys. 1.2), określonej objętości próby. Objętość badanej próby zależy od spodziewanego stopnia jej zanieczyszczenia. Komórki zatrzymane na filtrze najczęściej barwi się odczynnikiem DAPI, oranżem akrydyny lub erytrozyną i liczy pod immersją w 20-30 polach widzenia. Następnie oblicza się średnią liczbę komórek w jednym polu widzenia i przelicza na 1 cm³ wg wzoru:

ab

n --,

V

gdzie:

n - liczba komórek w 1 cm³, a - średnia liczba komórek w 1 polu widzenia,

b - liczba pól widzenia na powierzchni filtra (stosunek powierzchni filtra do powierzchni pola widzenia),

V - objętość badanej próby (cm³).

11.3. Metody pośredniego określania liczebności drobnoustrojów

Do metod pośrednich liczenia drobnoustrojów zalicza się metody hodowlane. W razie spodziewanego znacznego zagęszczenia mikroorganizmów w badanym materiale lub hodowli należy wykonać rozcieńczenie badanego materiału. Ma to zastosowanie szczególnie w badaniach ilościowych i izolacji czystych kultur. Do wykonania dziesięciokrotnych rozcieńczeń używa się roztworu soli fizjologicznej (0,85% NaCl) lub płynu Ringera, rozlanych do probówek po 9 cm³. W celu wykonania pierwszego rozcieńczenia 1:10 (10^_1) należy przenieść za pomocą jałowej pipety 1 cm³ badanego materiału do 9 cm³ soli fizjologicznej, umieszczając pipetę tuż nad powierzchnią płynu (nie wolno zanurzyć jej w płynie). Wymieszać zawartość probówki ruchem kołowym, a następnie przez wciąganie i wypuszczanie płynu jałową pipetą. Tą samą pipetą pobrać 1 cm³ i przenieść do drugiej probówki. W ten sposób otrzymuje się drugie rozcieńczenie: 1 : 100 (10^-2). Postępując w ten sposób, używając za każdym razem nowej pipety, wykonuje się kolejne rozcieńczenia: 1 : 1000, 1 : 10 000 itd. (10^-3, 10^-4 itd.) - rysunek 11.3. Rozcieńczenie środowiska stałego (gleba, pasza) wymaga odważenia 1 g badanego materiału, który przenosi się do 9 cm³ soli fizjologicznej i wytrząsa się pi'zez 2-3 min w celu uwolnienia największej liczby drobnoustrojów zaad-sorbowanych na cząstkach stałych. Po sedymentacji cząstek stałych zawiesina znad osadu służy do wykonania kolejnych rozcieńczeń - w sposób wyżej opisany. Należy pamiętać, że 1 g materiału i 9 cm³ soli fizjologicznej stanowi rozcieńczenie 10^_1.

92