patofizjologia ćw 4 (ćwiczenie praktyczne)

^{1 f//}7

Wi

*/#/

.... "■*Ve*3eS‘

O/nac/iinic ulżenia hsptoglobiny w surowicy (met. upnM/tiona)

Metody ilościowego oznaczania haploglohiny w surowicy polegają głównie na pomiarze aktywności peroksydazowej kompleksu hnptoglobiny (Hp)/ hemoglobina (Hb)

Kompleks lip z hemoglobiną (HP-Hb), jak i z methemoglobiną (HP-MetHb) wyk-t/ujc właściwości peroksydazowe 4-krotnie silniejsze niż sama hemoglobina i rozkuta -^odę utlenioną / uwalnianiem atomowego tlenu o dużych właściwościach utleniających.

IX> celów praktycznych stosowana jest metoda Owena i wsp.

Odczynniki:

1.    Odczynnik gwajakolowy : 3,72 ml gwajakolu (post. alkohol.) rozpuścić w 700 mi wody do której dodano 100 ml IM roztworu kwasu octowego.

Doprowadzić pH do 4,0 za pomocą 1 M NaOH i całość dopełnić do 1000 ml

2.    0.05 M roztwór H?O_ł; 2,8 ml 3% H₂Q2_dopęłnić H₂0 dest, do 5QmUrozE*£l pr/ygotQ. waćJ^^fefidpjo p.rzęjdużyęięm !!!

3.    Roztwór methemoglobiny: do 25 ml roztworu Mb ( stężenie 0,62 mmol/l) dodać 10 ml 0,1% w/v żelazicyjanku potasowego w celu przekształcenia Hb w MetHb

Po 10 min objętość uzupełnić wodą do 500 ml.

Roztwór może być przechowywany w temp. 0°C przez kilka miesięcy.

4.    0,15 M roztwór NaCl: 8,7 g NaCl rozpuścić w H₂Ó dest. do lOOOml.

POSTĘPOWANIE

•    Do 0,5 ml surowicy dodać 2 ml 0,15 M NaCl i dokładnie wymieszać

•    Do dwóch probówek (oznaczyć 1 i 2) odpipetować po 0,5 ml w/w rozcieńczonej surowicy

•    Przygotować pr. nr 3 i 4 zawierające po 2,5 ml odczynnika gwajakolowego ( umieścić na 10 min. w łaźni wodnej w temp. 25 °C.

•    Do pr. nr 1 dodać 0,5 ml roztworu methemoglobiny

•    Do pr. nr 2 dodać 0,5 ml H₂0 dest. (kontrola)

•    Do pr. nr 3 dodać 0,05 ml zawartości pr. 1

•    Do pr. nr 4 dodać 0,05 ml zawartości pr. nr 2

Jednocześnie natychmiast dodać do prób 3 i 4 pę> Q_tg mlpryygQW.WWKł9 tgnpglS roztworu    o temp.25 °C )- wu pkt.2 - odczynniki !!_!,

Po 8 min inkubacji (25 ⁰ C), po wyjęciu próbek z łaźni dokonać odczytu próbki 3 wobec próbki 4 przy A.® 470 nm.

Stężenie haptoglobin odczytuje się z krzywej wzorcowej. Otrzymane wartości pr/clic/yc na g/1000 ml surowicy.

Uwagą ipopięwaź jHyawuuąęc się zabarwienie iętiągwajaklLlu jssl UUk Od $^NNkUło jl/iciUK rulc/v ję wy woły w, u w zakrytej la/ni wojnej, •» do momcnlu odczytu owinie lip w c/.uny papier.