Projektowanie zestawu do RT PCR

Jak zaprojektować zestaw startery/sonda do oznaczeń metodą real-time PCR?

1.    W przeglądarce internetowej otwórz stronę firmy Integrated DNA Technologies (http://eu.idtdna.com/home/home.aspx).

2.    W zakładce SciToo/s kliknij na PrimerQuest

3.    Do okna Seąuence przekopiuj analizowaną sekwencję nukleotydową lub wprowadź ją poprzez podanie numeru rekordu z bazy danych sekwencyjnych (ąccession no).

4.    Dla wprowadzonej sekwencji zadaj opcje PCR Primers with Probe oraz Real-Time PCR.

5.    Kliknij Calculate i zapoznaj się z wynikami analizy.

6.    Przejdź do interfejsu Advanced (dotychczas korzystałeś z Basic) i wprowadź lokalizację regionu wyłączonego z analizy (Excluded region) - np. 300,500.

7.    Kliknij Calculate i zapoznaj się z wynikami analizy.

8.    Dla dwóch z uzyskanych zestawów startery/sonda przeprowadź analizę skłonności do tworzenia homo i heterodimerów oligonukleotydowych. W tym celu w nowym oknie przeglądarki internetowej otwórz program OligoAnalyzer (również z zakładki SciTools).

9.    Do okna Seąuence przekopiuj sekwencję(e) analizowanych oligonukleotydów (ze strony Results programu PrimerOuest) a następnie kliknij Self-dimer lub Hetero-dimer.

10.    Porównaj otrzymane wartości AG dla poszczególnych zestawów startery/sonda.

11.    Dla dwóch z uzyskanych zestawów startery/sonda przeprowadź analizę skłonności do tworzenia struktur drugorzędowych w obrębie odpowiednich amplikonów. W tym celu w nowym oknie przeglądarki internetowej otwórz stronę z pakietem Seąuence Manipulation Suitę (http://www.bioinformatics.org/sms/).

12.    Do okna programu Filter DNA przekopiuj sekwencję amplikonu odpowiadającego danemu zestawowi startery/sonda - znajdziesz ją w zakładce Set Detciils interfejsu Results programu PrimerOuest. Kliknij Submit.

13.    Odfiltrowana sekwencja zostanie zwrócona w oknie wynikowym (output window) -przekopiuj ją do otwartego w nowym oknie przeglądarki internetowej interfejsu programu mFold (z zakładki SciTools). Kliknij Submit.

14.    Porównaj struktury drugorzędowe i odpowiadające im wartości AG oraz Tm dla obydwu amplikonów.

15.    Spróbuj znaleźć dla badanej sekwencji optymalny zestaw startery/sonda przy użyciu programu Real-Time PCR (również z zakładki SciTools).

16.    Spróbuj odnaleźć gotowy zestaw primery/sonda na stronie firmy Applied Biosystems:

Products > Real-Time PCR > Gene Expression Assays & Arrays > Individual Assays > TaqMan® Gene Expression Assays