scan0050 2

4. PRZYGOTOWANIE MATERIAŁU POSIEWOWEGO DO HODOWLI PRZEMYSŁOWYCH

4.1. Uwagi ogólne

Kultura mikroorganizmów używana jako materiał posiewowy (inokulum) w hodowli przemysłowej musi spełniać kilka warunków:

—    musi być zdrowa w stanic aktywnym, co minimalizuje czas trwania fazy adaptacji,

—    musi być dostępna w wystarczającej ilości,

—    powinna mieć odpowiednią formę morfologiczną,

—    musi być wolna od zanieczyszczeń,

—    musi utrzymywać zdolności do wytwarzania pożądanego produktu.

Istotnym czynnikiem dla otrzymania inokulum spełniającego te kryteria jest

dobór właściwej pożywki. W procesie namnażania inokulum kwestia wytwarzania produktu nic jest najistotniejsza — chodzi o namnożenie mikroorganizmów. Często zatem stosuje się inne media do namnażania mikroorganizmów, a inne do końcowej hodowli produkcyjnej.

Stwierdzono, że długość fazy adaptacji kultury w hodowli przemysłowej jest krótsza dla inokulum wzrastającego na takiej samej pożywce jak medium produkcyjne. Dlatego podejmuje się starania aby medium do namnażania było zbliżone do końcowego medium produkcyjnego. Ogólnie, media do namnażania inokulum mają mniejsze wartości odżywcze i zawierają mniejsze stężenie substratu węglowego niż media produkcyjne.

Ilość inokulum wynosi od 3 do 10% objętości pożywki. Poczynając zatem od kultury przechowywanej np. na skosach, inokulum musi być namnożone w kilku stopniach. Najczęściej stopnic te obejmują dwa lub trzy etapy hodowli w kolbach na wytrząsarkach oraz od jednego do trzech stopni hodowli w fermentorze.

W procedurze tworzenia inokulum przemysłowego, wraz ze zwiększaniem się stopni hodowli, wzrasta ryzyko infekcji, zanieczyszczenia lub degeneracji kultury. Ten czynnik należy brać pod uwagę przy opracowywaniu techniki namnażania materiału posiewowego.

Typowy schemat namnażania inokulum wygląda następująco:

1)    kultura mateczna jest przesiewana na podłoże stałe;

2)    około 10 kolonii mających typową morfologię dla szczepu produkcyjnego jest selekcjonowanych i przesiewanych na skosy, tworząc tzw. kulturę submateczną. Kultury submateczne są używane jako kultury startowe do każdej nowej szarży;

3)    kultury submateczne są testowane przez namnożenie mikroorganizmu w kolbach wstrząsanych i sprawdzenie własności producenta;

4)    kultury submateczne są używane do inokulacji kolb (250 lub 500 ml);

5)    namnożone w kolbach mikroorganizmy są używane jako inokulum do następnych hodowli w kolbach lub w fermentorach;

6)    czystość kultury jest sprawdzana po każdym stopniu pasażowania.

Inna technika polega na tym, że pojedyncza kolonia wyhodowana z kultury submatecznej jest używana do zaszczepienia ciekłej pożywki i hodowana do osiągnięcia maksimum fazy wzrostu wykładniczego, a następnie przenoszona jest do większej objętości pożywki (ok. 20-krotny wzrost objętości) i ponownie inkubowana do osiągnięcia wykładniczej fazy wzrostu. Następnie zawiesina komórek jest przenoszona do kolbek o pojemności ok. 20 cm³. Kolbki są zamrażane i przetrzymywane w temperaturze -20°C. Kolbki są używane jako inokulum do fermentora posiewowego (stanowią ok. 5% objętości). W kolejnych stadiach objętość wrasta ok. 20-krotnie (tzn. posiew stanowi 5%).

Dla każdego konkretnego szczepu i typu produkcji schemat namnażania inokulum może być nieco inny, mniej lub bardziej rozbudowany. Istotne znaczenie ma typ mikroorganizmu i rodzaj stosowanego do zaszczepiania materiału biologicznego (kultura mikroorganizmów, spory grzybów).

4.2. Przykłady

W browarach często używa się drożdży z zakończonej fermentacji do prowadzenia nowej. Zwykle drożdże nie są używane więcej niż 5-10 razy do prowadzenia fcnncntacji. Świeże inokulum przygotowuje się z czystej kultury i namnaża zwylde dwustopniowo.

Dla przykładu: objętość I stopnia może wynosić 1,5 dnv\ objętość stopnia II 150 dnr’ (posiew stanowi tylko 1% objętości brzeczki). Namnażanie w każdym stopniu trwa 3-4 dni. Drożdże namnożone w II stopniu wystarczą do zaszczepienia fermentora produkcyjnego o objętości 1000 dm\

Drożdże piekamiane namnaża się trójstopniowo (podane wartości masy drożdży stanowią jedynie przykład):