scan0139

216

metabolitów takich jak: cukry, choresterol, mocznik itp. odgrywa bardzo dużą rolę w diagnostyce medycznej oraz w badaniach produktów'spożywczych. ‘

W niektórych analizach w diagnostyce medycznej używa się enzymów jako znaczników połączonych z odpowiednimi specyficznymi przeciwciałami, co umożliwia szybkie i łatwe oznaczanie hormonów, immunoglobulin itp. Enzymy używane w pracach analitycznych muszą być czyste.

Rozpatrzymy obecnie kilka przykładów zastosowania enzymów w analityce. Alkohol można oznaczać przy użyciu dehydrogenazy alkoholowej, która katalizuje jego przekształcenie w aldehyd, przy jednoczesnym przeniesieniu wodoru na awunukleotyd nikotynamidoadeninowy (NAD). Mierząc absorpcję promieniowania o długości fali 340 nm, charakterystycznej dla NAD, określa się stężenie etanolu.

Fruktozę można oznaczać dzięki kompleksowi enzymów zawierającemu heksokinazę, izomerazę fosforoglukozową oraz dehydrogenazę 6-fosforoglu-kozową. Schemat reakcji jest następujący:

fruktoza + ATP ♦=* 6-fosforofruktoza + ADP

6-fosforofruktoza i=ł ó-fosforoglukoza

6-fosforoglukoza + NADP i=? 6-fosforoglukonian + NADPH + H*

W tym przypadku mierzy się absorpcję charakterystyczną dla NADPH. Glukozę można oznaczać wykorzystując oksydazę glukozową, peroksydazę oraz odpowiedni chromogenny akceptor tlenu, np. orto-toluidynę lub orto--dwunizydynę.

W wyniku utleniania glukozy przez oksydazę glukozową powstaje nadtlenek wodoru. Peroksydaza powoduje redukcję nadtlenku wodoru i utlenienie związku chromogennego. Forma utleniona tego związku jest barwna i łatwa do detekcji. Omówiona metoda jest stosowana m.in. do oznaczania stężenia cukru we krwi.

Szczególnie szybki rozwój metod enzymatycznych w analityce związany jest z tzw. biosensorami. Pod tym pojęciem rozumie się układy złożone z im-mobilizowanego jednego lub kilku enzymów oraz przetworników przekształcających zmiany chemiczne w odpowiedni sygnał wielkości fizycznej.

Z uwagi na rodzaj stosowanego przetwornika można wyróżnić kilka grup biosensorów:

— Elektrochemiczne, w których mierzone są zmiany właściwości elektrycznych. Do grupy tej należą biosensory wyposażone w przetworniki konduk-tometryczne, potencjometryczne, amperometryczne i kulometryczne. Przetworniki konduktometryczne zbudowane są z jednej lub dwóch elektrod, mierzących zmianę przewodnictwa środowiska. Bezpośredni pomiar przewodnictwa roztworu między dwiema elektrodami pozwala na detekcję związków obdarzonych ładunkiem elektrycznym. W pomiarach z użyciem jednej elektrody mierzone są zmiany prądu, związane z adsorpcją oznaczanego związku na elektrodzie. Przetworniki potcncjometryczne mierzą zmianę potencjału na powierzchni elektrod jonoselektywnych, wynikającą z selektywnego wiązania się z jonami. Mogą służyć do detekcji dwutlenku węgla, amoniaku lub protonów, uwalnianych w reakcji enzymatycznej. Przetworniki amperometrycznc mierzą zmianę prądu w wyniku zachodzących na powierzchni elektrody reakcji utlcniania-redukcji. Przykładem mogą być elektrody mierzące obecność nadtlenku wodoru lub zmiany stężenia rozpuszczonego tlenu. Elektrody te cechuje zwykle duża selektywność, ale stosunkowo mała czułość.

-    półprzewodnikowe, wykorzystujące tranzystory połowę. W tego typu przetwornikach potencjał bramki jest zależny np. od zmiany pH środowiska. Czujniki te są wrażliwe na zmiany temperatury i pozwalają na jednoczesne oznaczanie kilku substancji.

-    Termiczne (cntalpimetryczne), zawierające termistory z unieruchomionym enzymem i mierzące zmiany efektów cieplnych reakcji katalizowanych przez enzym. Przetworniki tego typu są odporne na zakłócenia, takie jak barwa czy zmętnienie roztworu.

-    Mechaniczne. Do tej grupy należą przetworniki piezoelektryczne, mierzące zmiany częstotliwości drgań kryształu kwarcu w zależności od masy kryształu. Unieruchomiony na powierzchni kryształu enzym po związaniu z odpowiednim substratem zmienią masę kryształu. Bioscnsory piezoelektryczne są stosowane np. do wykrywania narkotyków i pestycydów fosfo-organicznych w stężeniu rzędu pg/kg. Czujniki te charakteryzują się małą bezwładnością i krótkim czasem reakcji. Wadą jest znaczne tłumienie oscylacji w środowisku ciekłym, co powoduje spadek czułości.

-    Optyczne, zwane czasem bioptrodami. Wykorzystują one pomiary absorpcji promieniowania, fluorescencji, chemiluminescencji i powierzchniowego rezonansu plazmidowego. Czujniki należące do tej grupy wykorzystują metody optyczne o dużej czułości i selektywności oraz właściwości światłowodów, pozwalających na przesyłanie światła na znaczne odległości. Z uwagi na małe średnice światłowodów (0,1-0,4 mm) możliwa jest znaczna miniaturyzacja czujników.

Oprócz biosensorów stosowanych do oznaczania pojedynczej substancji, dostępne są również aparaty wielofunkcyjne, umożliwiające oznaczanie kilku lub nawet kilkudziesięciu substancji. W urządzeniach tego typu stosowane są zestawy różnych czujników enzymatycznych iub wymienne biosensory.

Literatura uzupełniająca

1.    Biotechnologia żywności, pr. zb. pod red. W. Bednarskiego i A. Repsa. WNT. Warszawa 2003.

2.    J.W. Brcwcn The Production and Puriftcalion of Finc Enzymcs. w Basic Biotechnolog)'. J. Bu’Lock. B. Kristianscn (cas), Acadcmic Press, London 1987, 407-424.