image3 (9)

LuciLwi iaiu

nałożymy próbkę wirusa, który chcemy oczyścić (a właściwie doczyścić, bo wirowanie w gradientach gęstości stosuje się w końcowych etapach procedur oczyszczania) znaj. dujące się w tej próbce cząstki i cząsteczki będą przemieszczać się w głąb gradientu z szybkością proporcjonalną do gęstości tych cząstek. Im dalej w gradiencie, tym bardziej będzie rósł opór gradientu wobec przemieszczających się cząstek i tym bardziej ich przemieszczanie będzie się różnicować w zależności od różnic w gęstości.

Jeśli wirowanie zakończymy po niezbyt długim (30-40 minut) czasie, obecne w próbce cząstki i cząsteczki różniące się gęstością przemieszczą się w tym czasie w głąb słupka cieczy (w gradiencie) tak daleko, jak im na to pozwoli siła będąca wypadkową siły odśrodkowej ciągnącej każdą cząstkę w głąb gradientu i sił dyfuzji wypychających tę cząstkę ku górze, jeśli cząstka ta dotrze już do strefy, w której jej gęstość jest równa gęstości roztworu w tej warstwie gradientu. Cząstki różniące się gęstością znajdą się więc w różnych strefach gradientu po zakończeniu wirowania. Takie wirowanie nazywamy zwykłym wirowaniem w gradiencie gęstości (ang. rate-zonal density gradient centrifugatioń).

W wyniku krótko trwającego zwykłego wirowania w gradiencie gęstości sacharozy różne cząstki, w tym cząstki wirusa zawędrują więc w gradiencie tak daleko, jak im w tym krótkim czasie pozwoli ich gęstość w konfrontacji z gęstością gradientu. Możemy jednak wirowanie kontynuować tak długo, aż poszczególne cząstki zawędrują tak głęboko, jak im pozwoli ich gęstość, to znaczy do tej strefy gradientu, w której ich gęstość będzie równa gęstości gradientu w tym miejscu. Dalsze wirowanie niczego już nie zmieni. Rozdzielane cząstki nie będą przemieszczać się w głąb gradientu, bo im na to nie pozwoli jego zbyt duża już gęstość. Nie będą też wracać ku górze, bo im na to nie pozwoli przyspieszenie. Krótko mówiąc, gradient taki osiągnie stan równowagi, a rozdzielane cząstki będą zachowywać się jak składniki gradientu. Taki zabieg nazywamy równoważnym wirowaniem w gradiencie gęstości (ang. eąuilibrium density gradient centrifugatioń). Rozdział różnych cząstek jest w tym przypadku bardzo precyzyjny, ale wymaga to długiego wirowania (np. dobę).

Gradient opisany wyżej jest typowym gradientem schodkowym, w którym poszczególne strefy gęstości różnią się od siebie znacznie. W czasie długotrwałego wirowania gradient ten jednak samoczynni 2 przekształci się w gradient liniowy, w którym stężenie, a więc i gęstość będą rosły stopniowo i nie będzie dużych różnic na małych odległościach. Łatwo zauważyć, że w tego typu gradiencie lokalizacja cząstek o określonej gęstości po wirowaniu równoważnym jest bardzo precyzyjnie określona. Metodę tę wykorzystuje się nawet do wyznaczania gęstości cząstek wirusa.

Niezależnie od tego, z jakim gradientem mamy do czynienia i jak długo wirujemy, natychmiast po zakończeniu wirowania trzeba pozbierać oddzielnie poszczególne frakcje gradientu, zanim wymieszają się one ze sobą w drodze swobodnej dyfuzji. Poszczególne frakcje można zbierać od góry używając do tego urządzenia przesuwającego pipetę w dół lub probówką w górę o np. 2 milimetry po zebraniu każdej kolejnej frakcji. Można też wirowanie przeprowadzić w specjalnych probówkach, które potem dziurawi się od dołu i zbiera wyciekające kolejno frakcje o określonej objętości na automatycznym kolektorze frakcji.

Oczyszczanie wirusów metodą sączenia molekularnego. Technikę tę stosuje się w końcowych etapach oczyszczania dla doczyszczenia wstępnie już oczyszczonych preparatów. Preparat taki nakłada się na wierzch kolumny złożonej z granulek substancji tworzącej żel, np. agaru, agarozy, sefarozy (Sepharose) lub sefadeksu (Sephadex, dekstran). Żel uformowany jest z długołańcuchowych makrocząsteczek powiązanych ze sobą tak, że powstaje gęsta, trójwymiarowa siatka. Cząstki i cząsteczki zawarte w nałożonej na kolumnę próbce mogą przemieszczać się pod wpływem siły ciążenia albo między granulkami żelu (jeśli są zbyt duże, by wniknąć do samych granulek), albo też mogą wnikać mniej lub bardziej głęboko do wnętrza granulek, co w różnym stopniu opóźnia ich wędrówkę w dół kolumny. Im mniejsze cząstki, tym dłużej trwa ich wędrówka przez kolumnę.

Po określonym czasie kolumnę przemywa się odpowiednio dobranym rozpuszczalnikiem i zbiera oddzielnie frakcje wypływające kolejno z kolumny. W kolejnych frakcjach (eluatach) zawarte są cząstki różniące się wielkością, a zatem zdolnością wnikania w głąb granulek żelu. W jednej z tych frakcji lub w kilku kolejnych znajdą się cząstki wirusa.