katalaza 2

na jedną podjednostkę). Żelazo związane jest z układem porfitynowynt tworząc kompleks żelazoporfirynowy - hem [16]. Żelazo hemu, stanowiącego grupę prostetyczną katalazy i peroksydazy, łączy się wiązaniami kowalencyjnymi i koordynacyjnymi z atomami azotu układu porfirynowego, zaś z częścią białkową enzymu (apoenzymem) łączy się ono wiązaniami koordynacyjnymi [35]. Podczas reakcji katalizowanej przez katalazę żelazo to nie zmienia swego stopnia utlenienia. Budowę podjednostek katalazy poznano dzięki zastosowaniu strefowej elektroforezy kapilarnej. Techniką tą wykazano m.in. występowanie dwóch różnych podjednostek w katalazie, wynik ten potwierdzono, stosując elektroforezę w żelu poliakrylamidowym i chromatografię gazową na kolumnach kapilarnych [46].

Katalazy sklasyfikowano w dwóch grupach: typowe katalazy i dwufunkcyjne katalazo-peroksydazy. Typowe katalazy wykazują aktywność w dość szerokim zakresie pH (5.0-10.0), są oporne na działanie etanolu i chloroformu oraz są specyficznie hamowane przez 3-amino-l,2,4-triazol. Dwufunkcyjne katalazo-peroksydazy, które jak dotąd wykryto jedynie u drobnoustrojów, wykazują pewne własności odróżniające je od typowych katalaz. Optymalne pH wynosi dla nich 6.0-6.5, są bardziej wrażliwe na temperaturę, etanol, chloroform i H2O2 niż typowe katalazy i są niewrażliwe na 3-amino-l,2,4-triazol [31], W komórkach eukariotycznych katalaza stanowi typowy enzym wskaźnikowy peroksysomów, które posiadają m.in. system o-oksydacji kwasów tłuszczowych. Katalaza bierze udział w degradacji H2O2, powstałego w reakcji utleniania acylo-koen-zymu A w pierwszym etapie o-oksydacji kwasów tłuszczowych [32], Podstawowym zadaniem katalaz jest rozkład nadtlenku wodoru powstającego w licznych reakcjach metabolicznych zachodzących z udziałem oksydaz {lawinowych.

H2O2 + H2O2 -» 2H2O + O2

Reakcja rozkładu nadtlenku wodoru jest szczególnym przypadkiem reakcji hydro-peroksydazowej, w której H2O2 jest jednocześnie donorem i akceptorem wodorów. Donorem wodorów mogą być również niektóre związki organiczne, jak np. etanol.

Proces rozkładu H2O2 na I-I2O i O2 wymaga dużego nakładu energii. Obniżenie energii aktywacji prowadzi więc do znacznego wzrostu szybkości reakcji. W obecności katalizatorów następuje ogromne przyspieszenie reakcji. Energia aktywacji procesu rozkładu nadtlenku wodoru na H2O i O2 wynosi ok. 75 kJ/moi. Dodanie nieorganicznego katalizatora (platyna) obniża tę energię do 49 kJ/mol, zaś w organizmie w obecności katalazy wynosi ona tylko ok. 23 kJ/mol. W wyniku takiego obniżenia energii aktywacji reakcja zastaje przyspieszona w obecności platyny 20000 razy, zaś w obecności katalazy aż 3 x 10¹¹ razy [33]. Enzym ten charakteryzuje się zatem bardzo dużą aktywnością - liczba obrotów katalazy wynosi 2 x 10⁵ s¹. Dla porównania, liczba obrotów trypsyny i chymotrypsyny wynosi 100 s *. Pod względem szybkości działania katalaza ustępuje jedynie anhydrazie węglanowej [30j.

3. Nadtlenek wodoru jako sebstrat katalazy i możliwości jego wykorzystania

Powstający w reakcjach biochemicznych nadtlenek wodoru jest związkiem silnie toksycznym i gromadząc się w większej ilości może być zabójczy zarówno dla mikroorganizmów, jak i komórek organizmów wyższych. Dla przykładu, woda utleniona wytwarzana w procesach metabolicznych zachodzących w tkance nerwowej jest odpowiedzialna za zmiany chorobowe komórek nerwowych w mózgu [421. Również procesy starzenia się tkanki nerwowej związane z jej degeneracją są częściowo uwarunkowane wytwarzanymi w procesach metabolicznych aktywnymi formami tlenu, m.in. H2O2. Enzymy antyoksydacyjnc, w tym katalaza, usuwając nadtlenki opóźniają degenerację tkanki [27]. Ekspozycja fibroblastów na działanie niskich dawek nadtlenku wodoru (1 pmol) stymuluje ich proliferację. Wyższe stężenia H2O2 (100 pM - 1 mM) w środowisku hodowlanym komórek prowadzą do wzrostu jego stężenia wewnątrzkomórkowego, które hamuje proliferację fibroblastów i prowadzi do wzrostu ilości komórek ulegających apoptozie, czyli programowanej śmierci [6]. Na udział reaktywnych form tlenu w tym procesie wskazują obserwacje, z których wynika, że utleniacze (m. in. nadtlenek wodoru) bądź czynniki wyzwalające generowanie reaktywnych form tlenu takie jak: promieniowanie UV, czy TNF - indukują apoptozę, podczas gdy antyoksydanty takie jak: N-acetylocysteina, analogi witaminy E i peroksydaza glutationowa hamują procesy wyzwalające apoptozę [29],

Nadtlenek wodoru może być,mediatorem ekspresji roślinnych genów warunkujących systemową odporność na patogeny wirusowe. Ekspresja tych genów aktywowana jest poprzez kwas salicylowy, wytwarzany przez komórki roślinne i pełniący rolę cząsteczki sygnałowej w procesie odpowiedzi immunologicznej rośliny. Receptorem wiążącym kwas salicylowy jest białko o aktywności katalazy [8,9]. Połączenie się cząsteczki tego kwasu z katalazą powoduje obniżenie o 80% jej aktywności enzymatycznej, co powoduje znaczny wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia nadtlenku wodoru. Powyższą sugestię potwierdza fakt, iż do ekspresji tych genów dochodzi również po nastrzyknięciu liścia rośliny 1-5 mM H2O2 lub roztworami związków promujących tworzenie się nadtlenku wodoru wewnątrz komórek (np. parakwatu). Istnieje duże prawdopodobieństwo, że czynniki aktywujące ekspresję genów odpowiedzialnych za odporność na patogen są aktywowane poprzez reakcję typu “redoks", w której bierze udział nadtlenek wodoru [29],

Niektóre pasty do zębów obecne na rynku zawierają niewielkie ilości H2O2. Nadtlenek wodoru stosowano w stomatologii w postaci wolnej lub w kombinacji z solami przez ponad 70 lat. Wzrastające zapotrzebowanie na środki wybielające zęby zawierające lub wytwarzające aktywnie nadtlenek wodoru, skłoniło wielu badaczy do przeprowadzenia testów określających toksyczność stosowanych dawek H2O2. W trakcie badań przeprowadzonych w ciągu 6 lat wykazano jedynie sporadyczne przypadki przejściowego podrażnienia przez H2O2 śluzówki jamy ustnej u osób z owrzodzeniami. Wskazano również na możliwość zastosowania nadtlenku wodoru jako czynnika terapeutycznego w zapobieganiu paradontozie [40], Jako środek wybielający stosowano go także w przemyśle tekstylnym. Nadtlenek wodoru z powodzeniem był również wykorzystywany jako środek służący do sterylizacji niektórych artykułów spożywczych, szczególnie mleka. WFAO i UNAO dopuszczają możliwość dodawania do mleka 0,05-0,25% II2O2 jako środka antyseptycznego pod warunkiem, że po sterylizacji mleka pozostałości (1:02 zostaną usunięte przy udziale katalazy [14], Nie stwierdzono niekorzystnego oddziaływania nadtlenku wodoru na występujące w mleku aminokwasy, witaminy, cukier, tłuszcze oraz na jego smak [39].

7 *,