Obraz3

2.2. Postępowanie

a) Preparatyka inwertazy

10 g drożdży piekamianych rozetrzeć w ochłodzonym moździerzu porcelanowym z ziemią okrzemkową (około 5 g) i następnie dodać porcjami 10 ml toluenu (pod wyciągiem!) . Rozcierać preparat aż do uzyskania konsystencji kremu. Nie przerywając rozcierania, dodać do zawiesiny małymi porcjami 30 ml wody destylowanej.

Mieszaninę pozostawić w łaźni lodowej na 20 - 30 min (mieszając od czasu do czasu), a następnie odwirować osad (10 min x 3 000 obr/min). Po wirowaniu w probówce widoczne są trzy warstwy jak na schemacie :

■ Tłuszcze

Mętny ekstrakt enzymu

Osad ziemi okrzemkowej i fragmentów komórek

Zlać ostrożnie ekstrakt znad osadu do małej zlewki, pobrać porcję 10 ml roztworu i ochłodzić w mieszaninie chłodzącej a następnie, mieszając ciągle, dodać małymi porcjami 30 ml acetonu (ochłodzonego do -20° C).

Pozostawić mieszaninę na 15 min w łaźni z lodem, po czym odwirować osad wytrąconego białka (10 min x 3 000 obr/min); zlać roztwór znad osadu, a osad białka rozpuścić w 5 ml wody destylowanej (dodawać małymi porcjami !). Po rozpuszczeniu odwirować preparat (15 min., 15000 x g ) celem otrzymania klarownego roztworu Otrzymany preparat inwertazy przechowywać zamrożony w - 20°C.

2.3 Wyznaczanie szybkości początkowej reakcji katalizowanej przez inwertazę.

Zgodnie z zaleceniami Międzynarodowej Unii Biochemicznej, aktywność enzymatyczna powinna być wyrażona w jednostkach międzynarodowych (U) lub katalach (mikro- lub nanokatalach)

Międzynarodową jednostką aktywności enzy mu (U) jest taka jego ilość, która powoduje powstanie 1 jamo la produktu (lub rozkład 1 umola substratu) w ciągu 1 minuty w standardowych warunkach.

Aktywność (U) preparatu enzymatycznego przypadająca na 1 mg białka jest określana jako aktywność właściwa - rośnie ona podczas oczyszczania enzymu i usuwania białek balastowych, osiągając stałą wartość dla oczyszczonego, jednorodnego enzymu.

W obliczeniach kinetycznych posługujemy się pojęciem szybkości początkowej reakcji (v₀); jest to ta część reakcji enzymatycznej podczas której przyrost produktu jest liniowo zależny od czasu, zależność ta jest różna dla różnych enzymów.

Graficznie szybkość początkową reakcji enzymatycznej można wyznaczyć przez wykreślenie stycznej do punktów początkowego odcinka rzeczywistej (wyznaczonej doświadczalnie) krzywej reakcji enzymatycznej.

3