83335

Otrzymywanie preparatu inwertazy (Ćwicz. 1A)

Do izolacji inwertazy zastosowano homogenizację drożdży ze względu na wystarczająco wysoką do dalszydi badali aktywność otrzymanego preparatu i krótki czas trwaiua procedury.

Wykonanie:

10 g s'wieżych drożdży piekarskich zliomogenizować w 50 ml zimnej wody destylowanej za pomocą hoinogenizatora ostrzowego (5 tys. obrotów/min., przez 2 min.). Podczas homogenizacji należy utrzymyw ać niską temperaturę za pomocą nueszaniiiy wody z lodem. Homogenat odwirować (w wirówce K-23 po wyważeniu gilz parami) przy 3 tys. obrotów/min., przez 15 min. Uzyskany supernatant, zawierający surowy enzym, zlać do dwóch podpisanych naczynek i jedno z nich przechowywać w lodówce (+4°C), a drugie w temp. -20°C (po zamrożeniu). W razie potrzeby supernatant należy przesączyć przez Miradotli.

Do dalszych badań będzie używany otrzymany preparat inwertazy, po odpowiednim rozcieńczeniu - bezpośrednio przed oznaczeniami.

Wyznaczanie optymalnego stężenia preparatu enzymatycznego (Ćwicz.2)

Przygotować dwa różne rozcieńczema (w zimnej HjO dest.) preparatu inwertazy otrzymanego na poprzednich ćwiczeniach (ćwicz. 1A) - np.50- i 100-krotne.

Do probówki zawierającej 3 ml roztworu enzymu o odpowiednim rozcieńczeniu dodać 3 ml 0,2 M roztwom sacharozy w buforze octanowym o pH 4,7.

Natychmiast po wymieszaniu fpróba odczynnikowa!, a następnie dokładnie po 5, 10, 15, i 30 min. pobierać po 1 ml mieszaniny inkubacyjnej do probówek zawierających po 4 ml buforu glicynowego o pH 10 (w celu zatrzymama reakcji enzymatycznej).

Po wymieszamu, z każdej z tych probówek przenieść po 1 ml roztwom do odpowiednio oznakowanych probówek (z korkiem) zawierających 1 ml świeżo przygotowanej mieszaniny odczynników Somogyi I i II. Probówki należy szczelme zatkać i ogrzewać przez 15 min. we wrzącej łaźni wodnej.

Po osmdzeniu pod bieżącą wodą dodać po 1 ml odczynnika Nelsona, intensywnie wymieszać (micro-shaker) aż ustanie wydzielaiue pęcherzyków gazu i cały Cu ..O rozpuści się, a następme (po około 5 min.) dodać 2 ml H..0 i wymieszać (przez odwracanie probówek zatkanych korkami).

Po dokładnym wymieszaniu odczytać absorbancję dla poszczególnych wariantów czasu (5,10,15, i 30 min.) przy długości fali 520 nm wobec próby odczynnikowej (t=0).

Z przygotowanej wcześmej krzywej kalibracyjnej (ćwicz. IB) odczytać stężenie (pg/rnl) monosacharydów uwolnionych podczas enzymatycznej hydrolizy sacharozy. Przy wyborze rozcieńczenia preparatu enzymatycznego do dalszych badań należy kierować się tym, aby przewidywane wartości absorbancji mieściły się w wiarygodnym zakresie krzywej kalibracyjnej.

2