274845122

Reakcję rozpoczyna się dodaniem 1,0 ml otrzymanego preparatu tyrozynazy do zlewki nr I zawierającej mieszaninę reakcyjną. W czasie trwania pomiaru należy mieszać mieszaninę reakcyjną na mieszadle magnetycznym. W celu oznaczenia produkcji L-DOPA pobierać co 20 minut po 500 pl próby ze zlewki i przenosić kolejno do uprzednio przygotowanych probówek zawierających 2 M HC1. Po zakończeniu reakcji dodać po 1000 pl mieszaniny 15% molibdenianu amonu z 15% azotynem sodu. Zawartość probówek zamieszać na mikrowytrząsarce, a następnie do każdej dodać po 1000 pl 2 M NaOH i ponownie zamieszać. Po 5 minutach zmierzyć wartości absorbancji przy X = 460 nm (spektrofotometr) lub X = 390 nm (kolorymetr) względem odpowiedniej próby pobranej w czasie „0”.

B. Wyznaczanie krzywej wzorcowej do oznaczania L-DOPA

Do 7 jednorazowych, plastikowych i ponumerowanych probówek odmierzyć następujące ilości roztworów, jak przedstawiono w tabeli:

Roztwory	Nr probówki
	0	1	2	3	4	5	6
	pl roztworu
10 mM L-DOPA	0	20	40	60	80	100	120
Mieszanina reakcyjna	500	480	460	440	420	400	380

Przy użyciu pipety automatycznej dodać do każdej probówki po: 500 pl 2 M HC1 oraz 1000 pl mieszaniny 15% molibdenianu sodu z 15% azotynem sodu. Następnie zawartość probówek zamieszać na mikrowytrząsarce, dodać po 1000 pl 2 M NaOH i ponownie zamieszać. Po 5 minutach zmierzyć wartości absorbancji przy 8 = 460 nm względem próby odniesienia (probówka „0”)- Na podstawie uzyskanych wyników wykreślić krzywą wzorcową, odkładając na osi odciętych (0X) zawartość L-DOPA w poszczególnych próbach (w pmolach), a na osi rzędnych (0Y) wartości absorbancji (A).

C. Oznaczanie zawartości białka metodą Bradford - przykład

krzywa wzorcowa i oznaczenie zawartości białka w preparacie tyrozynazy zostało wykonane

przez prowadzących

Zawartość białka w preparacie tyrozynazy oznaczyć metodą Bradford, polegającą na pomiarze wzrostu absorbancji przy długości fali 595 nm, wywołanej powstaniem kompleksu barwnika Coomassie Blue G-250 z białkiem.

Preparat tyrozynazy (10-100 pl) odmierzyć za pomocą pipety automatycznej do suchej probówki na 10 ml. Objętość doprowadzić do 200 pl, dodać 3 ml odczynnika Bradford, zamieszać i po 5 minutach zmierzyć absorpcję przy 595 nm wobec próby nie zawierającej białka (tzw. materiałowej lub odniesienia). Próba materiałowa jest przygotowywana poprzez wymieszanie 200 pl wody z 3 ml roztworu Bradford.

Jeżeli ilość białka wzięta do oznaczania była odpowiednia, tzn. absorpcja wynosiła 0,1- 0,5, co odpowiada 5 do 25 pg białka, oznaczenie powtórzyć. Jeśli otrzymane wyniki odbiegają od tych wartości, oznaczenie powtórzyć, odpowiednio zmieniając rozcieńczenie białka. Z krzywej wzorcowej przygotowanej przez prowadzących ćwiczenia odczytać ilość białka w kuwecie i na tej podstawie obliczyć jego zawartość w preparacie tyrozynazy.

10