Untitled 

'i?

w różnych fazach rozwojowych roślin, względnie w różnych warunkach zewnętrzny^®-np. pod wpływem stresu. Cele te można osiągnąć przy użyciu zaproponowanej przez® Lianga i Pardee (1992) metody określającej zróżnicowanie składu produktóylp RT-PCR (DDRT-PCR). W pierwszym etapie część cząsteczek mRNA jest poddawr odwrotnej transkrypcji przy użyciu startera komplementarnego do ogona poli(Ą’ który zawiera dwa losowe nukleotydy selekcyjne od końca 3', np. 5'-T_mcJ Otrzymane nici cDNA są następnie amplifikowane w reakcji PCR z użyciem Startej T_nCA i startera dziesięcionukleotydowego o losowej sekwencji. Produkty amp| fikacji, znakowane radioaktywnie, są rozdzielane na długim żelu sekwencyjn ze względu na dużą liczbę prążków' otrzymywanych na autoradiogramach. Met tą można porównywać skład mRNA nie tylko w różnych tkankach roślini lecz również w liniach izogenicznych różniących się pod względem alleli dujących ważną cechę użytkową, np. odporność na patogenu. Przy tak zapl nowanym doświadczeniu metoda DDRT-PCR może doprowadzić do wyk: markera molekularnego sprzężonego z loeus cechy użytkowej lub do identyfi właściwego genu.    m

Markery AFLP

Polimorfizm długości amplifikowanych fragmentów (AFLP) jest metodą unio liwiającą fingerprinting DNA, która łączy zalety PCR i k* LP [331. Picrwsg etap AFLP polega na trawieniu oczyszczonego DNA dwoma enzymami restrykS nymi (rys. 8.2.5). Jeden z enzymów, rozpoznający sekwencje sześcionukleotydŚ (np. EcoRT) przecina dwuniciowy DNA znacznie rzadziej niż drugi enzym (np Msel) właściwy dla sekwencji czteronukleotydowych. Do tak otrzymanych fragnij tów restrykcyjnych przyłączane są z obu stron krótkie adaptory. Dwa startery służ|S do preamplifikacji mają sekwencję komplementarną tło części adaptorowej i miejs restrykcyjnego oraz jeden selekcyjny nukleotyd na końcu 3'. Zadaniem nukleotydo selekcyjnych jest ograniczenie liczby amplifikowanych fragmentów. Po wstępn amplifikacji, w mieszaninie reakcyjnej znajdują się liczne fragmenty DNA, której rozcieńczeniu będą stanowić materiał matrycowy dla właściwej, selektyw| amplifikacji. Jest ona prowadzona z użyciem starterów, różniących się od tyj} z pierwszej fazy oeecnością dwóch dodatkowych nukleotydów selekcyjnych.^ końcach 3'. Starter wiążący się z miejscem EcoRl jest wyznakowany izotopem ³|| Powielone fragmenty zostają rozdzielone w sekwencyjnym, denaturującym że poliakryloamidowym. Autoradiogram otrzymany po ok. 1 dniu ekspozycji składa na ogół z ok. 50-100 prążków tworzony: h przez wyznakowane, jednonició| fragmenty EcoRl/Mse 1. Ze względu na duże zagęszczenie prążków odczytywą autoradiogramu znacznie ułatwia komputerowa analiza obrazu.

Markery AFLP są przeważnie dominujące, lecz mimo to znajdują prze wszystkim zastosowanie w konstrukcji silnie zagęszczonych map genetycznych! Ich główną zaletą jest możliwość analizy wielu segregujących loci na jedny autoradiogramie. Ze względu na dużą rozdzielczość i wiarygodność, AFLP je wykorzystywany do identyfikacji odmian hodowlanych.

Genomowy DNA po oczyszczeniu

3GAATTCE3 ■ CTTAAG*

STTAAfS

MAATTm

trawienie DNA EcoRl oraz Msel

f Fragmenty EcoRI/MseP)

5'

Ti

aattces^^eest

G —AATy

llgacja ż adaptorami |

Fragmenty EcoRI/Msel po Hgacji z adaplorami

⁵Wst AATTCCSESaSSrTTA' ™ TTAAG MMMM AA'

PCR

, ,| wstępna selekcja fragmentów ^bGna aattci

Przyłączenie starterów preselektywnych

BS1AATTCA-

■ITTAAGM

rrABS

CAATra

Ul

Przyłączenie starterów selektywny St (starter EcoRl znakowany radioaktywnie)_

OH3AATTCACG ■TTAAGTi--

PCR

właściwa selekcja fragmentów

5’gsiaattc,

Namnożone fragmenty zawierające sekwencje ACG/ATG

1

arnpliłikacja selektywna

5'

Rozdzielone fragmenty o różnej dtugości uwidocznione na kliszy rentgenowskiej

EH AATTCACGE3SS2US3ATGTTAC3

elektroforeza denaturującym żelu poliakrylamidowym

Rys. 8.2.5. Strategia otrzymywania markerów AFLP

Bioteehnolrw>;-