Untitled 8

ąrkery ISSR

stwierdzeniu hybrydyzacji sondy z jednym z klonów, jest on sekwencjonowan ' w celu identyfikacji sekwencji flankujących mikrosatelitę. Następnym krokiem jJP zaprojektowanie pary specyficznych starterów o długości ok. 20 nukleotydL mających zdolność wiązania się po obu stronach mikrosatelity. Produkty anin]’ fikacji są rozdzielane w sekwencyjnym' żelu poliakryloamidowym i wybarwiaJfc azotanem srebra. Kodominacja i wysoki stopień polimorfizmu pozwalaia identyfikację wielu alleli w poszczególnych loci SSR. W celu lepszego wykorzS

tania całej długości żelu serie próbek są nanoszone sukcesywnie w odstęnarW czasowych.

Ponieważ konstrukcja mapy genetyczne; wymaga większej liczby markeróipi ' w przypadku SSR konieczna jest znajomość sekwencji 203-300 par starterów^ z których każda sonduje polimorfizm w jednym locus. Prze kładem ilustrujący^ zakres badań związanych z opracowaniem serii 230 markerów SSR u T. aestiv_utn ' jest praca Ródera i in. [28], Jej autorzy sekwencjonowali 1310 klonów, z których^ tylko jedna szósta utworzyła funkcjonalne pary starterów. Wysiłek włożony wstępnej fazie badań okazał się opłacalny, gdyż otrzymany zestaw starterów-umożliwił mapowanie 279 loci mikrosatelitarnych w jednej populacji mapującjl Równocześnie stwierdzono dużą genomową specyfikę markerów SSR, co oznać; ^ konieczność prowadzenia odrębnych opracowań dla każdego gatunku. Kodominac) i wysoki stopień polimorfizmu czynią z markerów SSR szczególnie przydaj narzędzie do mapowania i selekcji pożądanych genotypów.

•    (GA) tS5SES5Em(TCł (TC)    rrv , ..„■■■i

(CT) (CT).    (AG)    (AG)

iamplifikacja z użyciem starterów zakotwiczonych na końcu 3'

³ >=3S3(GA)_(GA),osaassa(TC) (TC)    I

“---A(AG)

(GA) A-«•

— (CT).(CT).'--** (AG). (AG)

‘■m

3(GA) (GA) ekiw.:--¹- -vi(TC) (TC) r ....

■ (CT), (CT)    (AG) (AG) hmm

iamplifikacja z użyciem starterów--^ zakotwiczonych na końcu 5'

■im

-3 (GA) (GA) t

CT) (CT) i

3 (TC) (TC)c-:

-(AG) EZ!

¹ (AG) (AG) ■■■

Rys. 8.2.3. Strategia otrzymywania markerów 'SSR zakotwiczonych końcem 3' (A) lub 5'

Sekwencje mikrosatclilarne stanowią również podstawę do projektowania starterzy umożliwiających otrzymywanie „odcisku palca” genotypów roślinnych.

Ziętkiewnsz i in. (1994) przedstawili prostą metodę generowania złożonych obrazów' prążkowyens wykorzystującą polimorfizm odcinków DNA pomiędzy sekwencjami mikrosatelitanvymi (ISSR). W metodzie tej stosuje się jeden starter o długości 17-18 nt, na który składa się sekwencja powtórzona, np. (CA)₈ i 1-2 nt selekcyjnych na końcu 3', warunkhjących przyłączenie startera do miejsca styku mikrosatelity z unikatowym DNA (ws. 8.2.3). Starter może być również zakotwiczony na końcu 5', za pomocą 2-3 losowych nukleotydów. Elektroforeza otrzymanych metodą ISSR licznych produktów amplifikacji prowadzona jest w poliakryloamidowym żelu sekwencyjnym. Detekcja prądów odbywa się na autoradiogranjach lub bezpośrednio w żelu przez barwienie azotanef^ srebra.

Markery MP-ACR

Fingerprinting DNA jest także uzyskiwany metodą ampUfikacji z użyciem starterów mikrosatelitarnych (MP-PCR). ReakcjaNańcuchowa /polimerazy jest prowadzona w obecności jednego startera o długości r§-16 nt/których sekwencja odpowiada mikrosatelitamemu DNA, np. (GT)₈, (GTGV ((MCA)₄, (TGGA), itp. Produkty amplifikacji są rozdzielane w żelu agar-.' towynyUrarwione bromkiem etydyny.

Polimorfizm losowo amplifikowanych mikrosątelitów^RAMP)

Polimorfizm losowo amplifikowanych rałkrosatelitów^ (RAMP) jest wykrywany z zastosowaniem amplifikacji prowadzonej w obecności owóch starterów, z których pierwszy wiąże się końcem 5' na styku sekwencji mikrostuelitarncj i unikatowej, a drugi - o arbitralnej sekwencji/10 nt, przyłącza się losowym miejscu. Przykładowe pary starterów używapie w metodzie RAMP to GT(CĄ)₄ + dziesięciomer lub GC(CA),, + dziesięciomer it:

Polimorfizm odcinków DNA pc/między retrotranspozonami (IRAP i REMAP)

Poza sekwencjami mikrosajiflitamymi, w diagnostyce molekularnej roślin, wykorzystywane są również retroj/anspozony, obecne w genomach w dużej liczbie kopii. Retrotranspozony reppeują się w drodze sukcesywnej transkrypcji, a następnie odwrotnej transkrypcji mRNA i insercji nowej kopii cDNA w umym\często oddalonym miejsejr w genomie. Ponieważ stara kopia retrotranspozonu pozostaje i.u swoim miejscu/rozmieszczenie tych ruchomych elementów pozostaje w przeważającej części stabilne z pokolenia na pokolenie. Jedną z grup retrotranspozonów, zawierających^ na swych końcach długie terminalne powtórzenia (LTR) jest zidentyfikowana u H. rnlgare rodzina BARE-1. Kalendar i in. (1999) opracowali dwa rodzaje markerów oparte na retrotranspozonach BARE-1 (rys. 8.2.4). W metodzie wykorzystującej polimorfizm odcinków DNA pomiędzy retrotranspozonami (IRAP). specyficzny starter przyłącza się do końcowych sekwencji LTR, końcem 3' na zewnątrz. Do amplifikacji fragmentów oflankowanych retrotranspozonami dochodzi

492