img043 (10)

Sekwencjonowanie automatyczne (metodą Sangera)

***0    *^0 cdNT*-. - —t. „i>, i

4H0 skO

W 1986r. wprowadzono pierwszy automatyczny sekwenator (Applied Biosystems)

Sekwencjonowanie w jednej probówce - ddNTPs znakowane czterema różnymi barwnikami fluorescencyjnymi (różna długość fali wzbudzenia i emisji), rozdział metodą elektroforezy kapilarnej

Zalety: szybkość, wydajność,

Wady: nierówne wysokości i szerokości pików, nieczytelny rozdział przy końcach sekwencji fragmentu DNA

analiza 300-1000 pz

r«SrtO*t,

i trx#*M«Sf oł (fo^uctł

——Od’ O

-<maQ

— cd» O -ddGO

■ cdC Q

*»c®

-I MG O

inttn

fluOftKfM b»-<r mc.* put r**,

(•l

CACCGCMCCA AAf t AAC» fCCAAAOI I AAGC i - CC.

Sekwencjonowanie metodą Sangera

Zastosowanie:

*    Wykrywanie mutacji punktowych oraz polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP)

*    Określanie nieznanych sekwencji

*    Sprawdzanie produktów PCR oraz wektorów

Przygotowanie próbki do sekwencjonowania

izolacja DNA

1

PCR

1

elektroforeza produktu PCR

1

oczyszczenie produktu PCR

1

PCR sekwencyjny (z użyciem jednego startera)

I

precypitacja produktu PCR sekwencyjnego

denaturacja

1

sekwencjonowanie

Pirosekwencjonowanie

* metoda wprowadzona na przełomie lat 80-tych i 90-tych

m TCOCAOTAJOO ans,

r...............¹    »

. ¹    ‘n-‘- _

• zasada metody - wykrywanie uwalnianego

podczas syntezy DNA pirofosforanu

■    polimeraza DNA - wstawiając kolejny nukleotyd do nici uwalnia pirofosforan (PPi)

•    sulfurylaza - przekształca PPi na ATP z wykorzystaniem adenozyno-S'-fosfosiarczanu (APS)

•    lucyferaza - reakcja ATP lucyferyną i tlenem dając C02, AMP, PPi i światło (jego natężenie jest rejestrowane, dl. fali 560 nm)

■    apiraza - wymagany w fazie ciekłej - degraduje nukleotydy do monofosoranu nukleotydu i nieorganicznego fosforanu

uAtp »^{1 2 3}:t¹    ► «¹n¹    ► ⁴¹¹⁹

*

'Y

...AOCOTCATtlchTAAATTO. .

tes***** •    • e°,

.......

— JSL—

1

dNTP są dodawane do mieszaniny pojedynczo-

2

jeśli nukleotyd jest właściwy to zostaje

3

wbudow any i rejestrowany jest sygnał świetlny