IMG (116)

Transformacja roślin tytoniu

Wiele czynników wpływa na efektywność transformacji roślin za pomocą A tumefaciens. Czynniki te można podzielić na (1) związane z rośliną, (2) związane z Agrobacterium oraz (3) związane z interakcją Agrobacterium - roślina. Do czynników wpływających na efektywność transformacji związanych z rośliną można zaliczyć: gatunek rośliny, genotyp, rodzaj eksplantatu używanego do transformacji i jego zdolność do regeneracji. Do grupy czynników związanych z Agrobacterium zalicza się: szczep (jego wirulencja), stabilność konstruktu, sposób przygotowania A. tumefaciens do transformacji. Do grupy (3) można zaliczyć podatność komórek roślinnych na infekcję Agrobacterium i długość kokultury.

Materiały:

sterylne rośliny tytoniu odm. „Petit Havana”

szczep A.tumefaciens LBA4404 zawierający odpowiedni plazmid

pożywka YEB z dodatkiem odpowiednich antybiotyków

pożywka płynna MSO (wg. Murashige i Skoog, 1962)

pożywka R (pożywka MS z dodatkiem fitohormonów)

pożywka stała RA (pożywka MS z dodatkiem fitohormonów i antybiotyków)

pożywka stała U w słoikach (z dodatkiem auksyny)

sterylna bibuła, skalpel, pincety, sterylne probówki SARSTAED 50ml, wirówka Beckman cieplarka, komora z laminamym przepływem powietrza

A. Przygotowanie bakterii

zainicjować hodowlę nocną/4.tumefaciens w płynnej pożywce YEB z dodatkiem odpowiednich antybiotyków, hodowlę prowadzić w temperaturze 28°C przy wytrząsaniu 180-200 rpm przez noc bakterie odwirować 10-15 min. przy 3500 rpm osad bakterii zawiesić w pożywce MSO

B. Transformacja krążków' liściowych

na dużą szalkę Petriego z wilgotną bibułą wyłożyć 1-2 liście tytoniu rosnącego w warunkach sterylnych

wyciąć główne nerwy, a pozostałe części liści pociąć na kwadraty długości krawędzi około 0,8 -l,0cm

ekspiantaty przenieść do nowej szalki i zalać przygotowanymi bakteriami na 15-30 min. fragmenty liści osuszyć na sterylnej bibule i wyłożyć na pożywkę R kokultywację prowadzić przez 2-3 dni w pokoju roślin (25°C, fotoperiod 16 godz.) po kokulturze przenieść ekspiantaty na pożywkę RA (z dodatkiem antybiotyku selekcyjnego oraz antybiotyku eliminującego A.tumefaciens)

kulturę prowadzić jak wyżej, ekspiantaty przenosić na świeże podłoże co 3 tygodnie regenerujące pędy o długości około lcm odcinać od kalusa i wykładać na pożywkę stałą U z dodatkiem antybiotyku selekcyjnego po ukorzenieniu roślinki przenieść do doniczek z ziemią

YEB - ekstrakt wołowy-5g/I, ekstrakt drożdżowy-5g/l, pepton-5g/I, sacharoza-5g/l, MgS0₄ - 2mM. MSO - makro- i mikroelementy oraz witaminy jak MS, sacharoza-30g/l, pH5.8 R - makro- i mikroelementy oraz witam, jak MS, sacharoza-30g/l, NAA-0,lmg/l, BAP-l,0mg/l, pH5.8 RA - jak R ale z dodatkiem antybiotyków: np. kanamycyna 75mg/l i klaforan 400 mg/1 U - makro- i mikroelementy oraz witaminy jak MS, sacharoza-30g/l, NAA-0,lmg/l, pH5.8.