W 5

Schemat klonowania genów

izolowanie łączenie z wektorem bakterie się dzielą bakterie zawierają ten sam fragment DNA rekombinowanie i klonowanie

• enzymy restrykcyjne lepkie końce, ligaza łączy cząsteczki

wektor plazmidowy

• cząsteczka za pomocą której namnaża się DNA

• bakterie (E.coli) łatwe do klonowania DNA

• eukariota drożdże dobre do badań DNA (klonowanie i ekspresja)

• wektory plazmidowe, mieszane, wirusowe

• wektor- niewielka cząsteczka Dna zdolna do replikacji

Wektor:

• origin replication- miejsce startu replikacji

• markery- oporność na Amlicylinę i Tetracyklinę

• wektor staje się oporny na ten antybiotyk; mieszamy wektor z bakteriami; szansa rozróżnienia wektora

• ileś miejsc restrykcyjnych by wstawić tam obce DNA nie niszcząc wektora

• gen lac Z - modelowy; jest markerem; gdy go ma to kolonie sa niebieskie na pożywce (koduje B-galaktozydazę)- on ma promotor 9start transkrypcji i translacji) można wstawiać obcy gen za promotor wektor ekspresyjny daje szanse na trkaskrypcję i translację

• polilinker- fragment DNA z gęstymi miejscami rozpoznwane przez enzymy

• fragmenty cięte tymi enzymami; wstawia się dużo enzymów bo ten fragment ma często być w fazie jak początek genu Z czytamy jako początek genu B-galaktozydazy; po to by ten wstawiany gen był w tej ramce to musi być dobrany enzym.

Fag lambda jako wektor

• kolista cząsteczka DNA - nieduża (49 tys nukleotydów)

• geny główki, ogonka, funkcji lityczne (enzymy rozpuszczają błonę komórki)

• replecable region - geny, które kontrolują funkcje pozostałe faga

• gen po replikacji pakowany w płaszcz fagowy

By zapakować DNA w płaszcz fagowy:

1 - DNA musi być długości jak cząstka fagowa

2 - musi mieć sekwencję COS - rozpoznawana przez białka wyrzucić środkowy regionzmieszać te cząsteczki to powstanie za krótka cząsteczka; ale gdy dodamy obce DNA do środka i to zapakowane i wniknie do komórki, bakteria w genomie ma zrekombinowanego faga

wektor fagowy nie ma selekcji na małe fragmenty zawsze ok. 10 tys. Nukleotydów

Fag M 13

• ma w cyklu życiowym etap w którym jest jednoniciowy dobudowywanie nici później produkcja pojedynczej nici i wbudowanie w płaszcz białkowy

• można wstawić obce DNA i otrzymać jednoniciowe fragmenty łatwe do sekwencjonowania

Wektor drożdżowy

• naturalny plazmid u drożdży

Wektor YAC

• sztuczny chromosom

• ma centromer z chromosomu drożdży

• miejsca startu replikacji

• ma telomery stabilnośc cząsteczki

• zachowuje się jak chromosom

• zdolność replikacji do trawienia enzym Eco R1 ma fragmenty łączymy je z odcinkami YAC

• otryzmujemy cząsteczkę która zachowuje się jak chromosom

• stosowane gdy chcemy zrobić bibliotekę genową w organizmach wyższego rzędu otrzymujemy w małych kawałkach

Cosmid

• wektor plazmid ma sekwencje z faga lambda kombinacja genów bakteryjnych i sekwencje COS łatwiejsza transformacja , płaszcz fagowy ułatwia wnikanie do komórki tworzenie biblioteki genowej w dużych kawałkach.

Wektor TC

• do konstruowania GMO

• do inżynierii genetycznej roślin

• plazmid u bakterii odpowiedzialnych za brodawki korzeniowe u roślin, ten plazmid i bakteria przenika do tkanek roślinnych tworzy brodawki przekazuje roślinom plazmid wprowadzeie genów do roślin

Adenowirus jako wektor

• używany dla zwierząt i człowieka w terapii genowej

• powoduje choroby płuc; wnika do nich

• DNA integruje się z chromosomamilecznie miażdżycy u ludzi

Klonowanie cDNA

• usyzkanie ludzkiej insulinysyntetyzuje się RNA;klonowanie

• na końcu dodawane fragmenty DNA biblioteki w wektorach

Odnajdywanie genów w bibliotece:

1 - komplementacja mutacji

2 - hybrydyzacja łysinkowa lub kolonijna

3- zastosowanie przeciwciał (jeśli gen działa i mamy przeciwciałaa na białko)