Biotechnologia 2

ROŚLINY MODYFIKOWANE GENETYCZNIE

Transgen - właściwy gen , przeniesiony do transformowanej rośliny. Nie ma on w genomie rośliny swojego odpowiednika w postaci allelu, stąd roślina transgeniczna jest heterozygotą.

Linie transgeniczna - samozapylane rośliny transgeniczne o nowym genotypie, dają potomstwo rozszczepiające się lub jednolite. Te ostatnie pochodzą z homozygoty i dają ustaloną linię transgeniczną.

Zmienność somaklonalna - rośliny powstałe z transgenicznej komórki mogą wykazywać różne zmienione właściwości, co nazywamy zmiennością somaklonalną - dziedziczoną trwale w kolejnych pokoleniach.

Metody wprowadzania obcych genów:

• Transformacja za pomocą Agrobacterium tumefaciens (metodą wektorową). Przydatna dla roślin 2-liściennych

• Transformacja bezpośrednia (metoda bezwektorowa) - mikrowstrzeliwanie. Przydatna dla roślin 1 i 2-liściennych

• Metoda pośrednia - stosująca komórki bakterii E. coli i A. tubifaciens jako biologiczne „pociski” do transformacji. Przydatna dla roślin 1 i 2 liściennych.

• Bezpośrednie transformowanie protoplastów za pomocą elektroporacji lub glikolu polietylowego.

Etapy transformacji wektorowej:

• Kokultywacja - umieszczenie eksplantatów (fragmentów liści, korzeni, liścieni) w roztworze bakterii

• Odpłukanie bakterii

• Umieszczenie eksplantatów na pożywce z antybiotykiem w celu zabicia bakterii

• Umieszczenie dalsze materiału na pożywce regeneracyjnej z odpowiednim czynnikiem selekcyjnym - antybiotykiem lub herbicydem. Geny markewowe zawarte w obrębie sekwencji granicznych na plazmidach kodują białko enzymatyczne warunkujące odporność na dany czynnik selekcyjny. Dzięki temu wzrost transgenicznych komórek będzie stymulowany, a nie transformowanych zaś hamowany.

• Regeneracja roślin, jeśli to możliwe, to najczęściej z pojedynczych transformowanych komórek. We wczesnym etapie regeneracji przeprowadza się testy na aktywność genów reporterowych wprowadzonych dodatkowo do plazmidów. Geny te odpowiedzialne są za kodowanie produktów, które łatwo wykrywa się testami enzymatycznymi. Histochemicznymi lub fluorymetrycznie (ß-glukuromidoza GUS, lucyferaza LUC)

Mikrowstrzeliwanie:

Zastosowanie metody:

Metoda polega na wstrzeliwaniu z bardzo duża prędkością rzędu kilkuset metrów na sekundę do komórek metali pokrytych DNA. Prędkość tę uzyskuje się w specjalnie skonstruowanych akceleratorach, czynnikiem przyspieszającym ruch cząstek metali jest proch strzelniczy lub obecnie hel.

Przydatność metody:

Rośliny jednoliścienne (cebula, wszystkie gatunki zbóż, trzcina cukrowa, tulipan), rośliny nagonasienne, rośliny 2-liścienne trudne do transformowania, np. fasola, soja.

Obiekt transformacji:

• Niedojrzałe zarodki

• Kalus embriogeniczny z zarodków

• Niedojrzałe kwiatostany

• Zawiesina komórek

Wady:

• Niska wydajność transformacji (mechaniczne uszkodzenia komórek)

• Odrywanie się metalu od DNA podczas opłaszczania

• Wprowadzenie do genomu roślinnego zbyt wielu kopii genu jednocześnie

Cechy modyfikowane:

• Hybrydy somatyczne (lucerna, kalafior, cykoria, kukurydza, rzepak, tytoń)

• Opóźnione dojrzewanie i starzenie (pomidor)

• Poprawa wartości odżywczych roślin i nasion (marchew, kukurydza, soja, tytoń, ryż)

• Tolerancja na różne stresy (lucerna, ziemniak, pomidor, tytoń)

• Zabarwienie kwiatów (chryzantema, gerbera, petunia)

• Wzrost zawartości i zmiana struktury tłuszczów (rzepak)

• Lepsze przetwarzanie (rzepak)

• Wyższy plon (zboża)

Łatwiej wprowadzić gen odporności na bakteria i wirusy niż grzyby

Rozmnażanie wegetatywne in vitro:

1. Powstanie zarodków somatycznych w kulturach komórek, tkanek i organów

2. różnicowanie pąków przybyszowych w kulturach kalusa

3. Różnicowanie pąków przybyszowych bez pośrednictwa tkanki kalusowej

4. Rozwój paków bocznych w kulturze merystemów wierzchołkowych

5. rozwój paków bocznych w kulturze fragmentów pędów i innych organów

6. kultury primodriów pędowych

Rozmnażanie wegetatywne in vivo:

1. organy przysposobione do rozmnażania wegetatywnego(skrócone pędy) → bulwy, cebule, kłącza

2. sadzonki → odcięte części roślin, np. liście pędy, korzenie

3. odkłady → pędy przez jakiś czas w trakcie ukorzeniania pozostają w kontakcie z rośliną

4. transplantacje → przeszczepienie części rośliny na inną roślinę

roślina ukorzeniona → podkładka

przebieg mikrorozmnażania - SKRYPT

Zdolności morfogenetyczne komórek roślinnych

Komórki roślinne są totipotentne, czyli mają zdolność do dzielenia się oraz odtwarzanie poszczególnych organów

Najbardziej przydatne są eksplantaty zawierające komórki merystemów wierzchołkowych, bocznych i interkalarnych, potem w kolejności komórki kambialne, Felom, okolnica i promienie rdzeniowe. Do regeneracji nie nadają się komórki wysoce wyspecjalizowane i zróżnicowane, np. komórki szparkowe, cewki, włókna, włoski wydzielnicze, sklerenchyma, itp.

U nasiennych regeneracja następuje łatwiej u gatunków 2-liściennych niż 1-liściennych, a najtrudniej u nagonasiennych. U każdego gatunku można jednak wybrać fragment rośliny dający dobre efekty w namnażaniu in vitro.

Jeśli zregenerowany organ powstał z grupy komórek niejednorodnych genetycznie, to otrzymamy chimerę.

Bodź cem wyzwalającym odróżnicowanie w kulturach in vitro jest odizolowanie komórek od tkanek rośliny matecznej oraz wpływ regulatorów.

Kultura kalusa (ad2):

Zastosowanie:

• materiał wyjściowy do otrzymania zawiesin komórkowych i protoplastów

• szeroko wykorzystywany do mikrorozmnażania i transformacji

• do pozyskania na skalę masową zarodków somatycznych

• do biotransformacji i pozyskania metabolitów wtórnych

• do badań podstawowych nad morfologią i strukturą komórki

Geneza:

• w wytwarzaniu kalusa (tkanki przyrannej) mogą brać udział wszystkie tkanki eksplantatu

• mogą brać też udział tylko nieliczne

Budowa tkanki kalusowej

• początkowo są to niezróżnicowane komórki parenchymatyczne o różnym kształcie i wielkości

• po pewnym czasie trwania kultury kalus wykazuje heterogeniczność: obok komórek parenchymatycznych powstają nieregularne formacje tkanek przewodzących, centra merystematyczne

• kalus może mieć strukturę luźną i łatwo się rozpadać lub bardzo zwartą

• barwa może być zróżnicowana od białej, żółtej, pomarańczowej przez różne odcienie zieleni

• analizy cytologiczne kalusa wskazują na wielką różnorodność genetyczną

Kultura pąków przybyszowych

W różnych częściach rośliny z mniej lub bardziej dojrzałych tkanek mogą powstawać wierzchołki pędów zwane przybyszowymi. Tworzą się one na różnych organach i liściach, łodygach i liściach. Pąki przybyszowe powstają z epidermy i subepidermy. Eksplantaty korzeniowe z budową pierwotną wytwarzają paki przybyszowe tworzą w korze pierwotnej, a z budową wtórną tworzą paki w sąsiedztwie albo w obrębie floemu wtórnego.

Metoda wykorzystywana do rozmnażania roślin cebulowych (z trudem wytwarzających pąki boczne) takich jak: Liliaceae, Iridaceae, Amarylidaceae oraz roślin ozdobnych z rodzin: Geraniaceae i Begoniaceae.

Embriogeneza somatyczna:

• jest procesem biologicznym, podczas którego formują się zarodki z komórek wegetatywnych

• wyzwolenie potencjału do wytworzenia się zarodka w pojedynczej komórce lub ich grupie nazwane jest indukcją embriogenetyczności

Budowa zarodka somatycznego

Istnieje wiele wspólnych cech w formowaniu zarodków somatycznych, a poszczególne stadia rozwoju zarodków są podobne lub wręcz identyczne.

Zarodki mają wyraźnie zaznaczoną biegunową strukturę typu pęd-korzeń a efektem końcowym embriogenezy somatycznej.

Zastosowanie:

Metoda ta może znaleźć istotne zastosowanie w nasiennictwie i szkółkarstwie, ze względu na niezwykle wysoki współczynnik rozmnażania.

---