18559 skanuj0045 (8)

Na rynku są dostępne także różne chipy genowe z DNA człowieka, zawierające m.in. geny, o których sądzi się, że zawiadują reakcją na związki toksyczne. Na razie interpretacja danych uzyskiwanych z analiz mikromacierzy jest daleka od doskonałości, ale mamy nadzieję, że w przyszłości całkowicie zastąpi metody badań naukowych, w których używa się zwierząt.

Bez zwierząt

zastępowanie to tworzenie takich metod, w których w ogóle nie wykorzystuje się żywych zwierząt. Co ciekawe, powstają one najczęściej nie jako wynik wyjątkowej wrażliwości badaczy na cierpienie, ale po prostu dzięki niezwykłemu rozwojowi tanich, szybkich i wydajnych technologii. Na przykład większość analiz hormonalnych (choćby testów ciążowych), które dawniej polegały na długotrwałych badaniach na zwierzętach, dziś wykonuje się metodami alternatywnymi (chemicznymi lub immunologicznymi).

Jedna z pierwszych metod zastępczych powstała właściwie przez przypadek. W latach siedemdziesiątych Henry Wagner z Johns Hopkins University zajmował się otrzymywaniem krótkożyciowych radioizotopów do stosowania w diagnostyce obrazowej. Ponieważ miały one być podawane ludziom, musiał mieć pewność, że nie zawierają bakterii ani ich toksyn. Można to było sprawdzić za pomocą testu na pirogcnność - czyli na obecność czynników wywołujących gorączkę, które najczęściej są pochodzenia bakteryjnego. Jednak znany wówczas test polegał na wstrzyknięciu badanej substancji królikom i mierzeniu temperatury ich ciała po upływie 24 godzin - oczywiście do tego czasu izotopy dawno by się rozpadły. Wagner, poszukując innej metody, skorzysta! z odkrycia dokonanego przez swojego uniwersyteckiego kolegę Fredericka Banga, który wykazał, że hemolimfa (odpowiednik krwi) skrzypłocza Limulus polyphemus reaguje na obecność kluczowych toksyn bakteryjnych w przewidywalny i mierzalny sposób. Tak powstał tzw. test LAL (Limulus amebocyte lysate), który bardzo szybko został zatwierdzony przez FDA jako metoda wykrywania pirogenów.

LEUKOCYT KRWI OBWODOWEJ w obecności bakterii wywołujących gorączkę wyrzuca białka zwane cytokinami. Analiza poziomu cytokin w próbce krwi jest prostym testem na obecność gorączkotwórczych bakterii, który z powodzeniem może zastąpić dotychczasowe drastyczne testy na królikach oraz wcześniejsze metody alternatywne.

Nie tak dawno Albrecht Wendel z Universitat Konstanz wespół z jednym z nas (Hartungiem) wykazali, że obecność toksyn bakteryjnych można wykryć jeszcze inaczej - analizując próbki ludzkiej krwi. Toksyny te bowiem, działając na obecne we krwi leukocyty, powodują wydzielanie białek zwanych cytokinami, których obecność jest dla mózgu sygnałem do podniesienia temperatur}' ciała. Wystarczy więc zbadać poziom cytokin we krwi poddanej działaniu badanej substancji, przy okazji pozbywając się kilku wad testu LAL.

Istnieją jednak również i takie metody zastępcze, których powstanie można bezpośrednio przypisać staraniom o ograniczenie cierpień zwierząt. Dotyczy to na przykład niezwykle bolesnego testu Draize’a. Dziesięć lat temu kilkoro badaczy zamiast na oczach żywych królików' zaczęło przeprowadzać go na świeżych gałkach ocznych pozyskiwanych z rzeźni. Choć może niezbyt estetyczna, metoda ta w oczywisty sposób eliminowała zarówno ból, jak i użycie dodatkowych zwierząt. Obecnie w Niemczech tego rodzaju badania przeprowadza się coraz częściej już nie na rogówce, ale na delikatnej błonic oddzielającej w kurzym jajku żółtko od białka.

W latach osiemdziesiątych Johns Hopkins Center for Al-ternatives to Animal Testing, kierowane przez Goldberga, rozpoczęło badania nad oddziaływaniem różnych substancji chemicznych na jednowarstwowe hodowle komórek ludzkiej rogówki. (Ośrodek, będący częścią Bloomberg School of Public Health, został założony przez Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association pod naciskiem innej kampanii prowadzonej przez „króliki", tym razem właśnie przeciw testowi Draize'a). Na podstawie m.in. wyników tych badań kilku firmom udało się wytworzyć trójwymiarowo układy komórek wiernie naśladujące zewnętrzne warstwy ludzkiego oka - model ten pozwala nie tylko wykrywać podrażnienia, ale także badać subtelne zmiany strukturalne.

Naukowcy umieją dziś hodować ludzkie komórki najrozmaitszych typów, pochodzące ze skór}’, oka, płuca, mięśni czy błon śluzowych. Potrafią nawet, co jeszcze bardziej niezwykłe, wytwarzać sztuczne tkanki - wielowarstwowe konstrukcje z wyspecjalizowanych komórek hodowanych na polimerowych zrębach. Do tej poty udało się uzyskać takie laboratoryjne odpowiedniki struktur oka, a także skór}', pluć, przewodu pokarmowego oraz błon śluzowych jamy ustnej i pochwy. Powszechnie przyjęły się one w przemyśle i zastąpiły zwierzęta w wielu różnych procedurach testowych. (Wciąż jednak nie udało się odtworzyć w laboratorium hodowlanym tak skomplikowanych narządów, jak wątroba).

Warto podkreślić, że hodowle komórkowe i tkankowe pozwalają na monitorowanie przebiegu procesów biologicznych w' sposób, jakiego nie da się osiągnąć w testach na żywych zwierzętach. Naukowcy mogą teraz odtwarzać „w probówce" poszczególne etapy odpowiedzi komórki na podaną substancję i obserwować na przykład zmiany aktywności genów, zaburzenia rozwoju i podziału komórek. W przyszłości dzięki temu będzie można przewidywać skutki działania związków chemicznych na ludzkie komórki w ich naturalnym środowisku - w organizmie. Jeszcze bardziej obiecujące są niedawne osiągnięcia AP Research w Baltimore. Opracowano tam sposób hodowli wielu różnych tkanek razem, co pozwala modelować in vitro takie procesy, jak przekształcenie związku chemicznego w jednym narządzie, dające metabolit oddziałujący na inny narząd. Tc niezwy-

76 ŚWIAT NAUKI MARZEC 2006

3KIEM KRYTYKA: Mogłoby być lepiej

W Polsce doświadczeniom poddaje się kilkaset tysięcy kręgowców rocznie (w roku 2004 było ich około 400 tys.). Jeszcze 10 lat temu takie eksperymenty prowadzono praktycznie bez żadnej kontroli, jeśli pominąć kilka najlepszych instytucji, które z własnej inicjatywy ustanowiły wewnętrzne komisje etyczne. Dopiero na mocy ustawy o ochronie zwierząt w 1999 roku powołano Krajową Komisję Etyczną (KKE), która - m.in. dzięki zaangażowaniu ówczesnego przewodniczącego KBN prof. Andrzeja Wiszniewskiego - w ciągu trzech miesięcy ustanowiła pierwszy w tej części Europy system mieszanych, lokalnych komisji etycznych. Następnie, w związku z wejściem Polski do Unii Europejskiej, uchwalono ustawę o doświadczeniach na zwierzętach, podwyższającą rangę komisji etycznych, uprawniając je m.in. do kontroli wykonania własnych decyzji. Niestety, realizacja jej postanowień ucierpiała, gdy byty minister nauki i informatyzacji w lecie 2005 roku zakulisowo powołał nowy skład KKE, do którego weszły także osoby niespełniające etycznych, fachowych i prawnych standardów. Decyzja ta wzbudziła obawy, że nowy skład zaprzepaści dotychczasowy dorobek KKE, i została zaskarżona. Bez właściwych ludzi nawet najlepszy system nie może działać. Problem ten ujawnia się także w komisjach lokalnych, w których jest odczuwalny niedobór kompetentnych przedstawicieli organizacji ochrony zwierząt. Ponadto żadna komisja nie jest w stanie bezpośrednio nadzorować sytuacji zwierząt. Dlatego w każdej placówce jest potrzebny ktoś, kto na co dzień czuwa nad dobrym traktowaniem zwierząt i współpracuje z eksperymentatorami, by maksymalnie złagodzić przebieg doświadczeń (co zresztą dobrze służy jakości wyników). Niestety, codzienny nadzór jest w ustawie sprowadzony do biurokratycznej fikcji i tylko w niektórych ośrodkach działają z własnej woli osoby zasługujące na miano instytucjonalnego opiekuna zwierząt. Tam, gdzie go brak, zwierzęta są często narażone na dodatkowe cierpienia z powodu zaniedbań, awarii (zwłaszcza w niedziele i święta) oraz braku koordynacji opieki.

prof. dr hab. Andrzej Elżanowski Instytut Zoologii Uniwersytetu Wrocławskiego

kłe osiągnięcia pozwalają wierzyć, że za jakiś czas uda się całkowicie wyeliminować zwierzęta z badań toksykodyna-micznych, w których analizuje się procesy rozprowadzania, przekształcania i wydalania substancji chemicznych.

Możliwe jednak, że ostateczna eliminacja żywych zwierząt z badań nastąpi wcale nie dzięki metodom in vitro, lecz raczej „in silico" - przemysł farmaceutyczny już dziś wykorzystuje komputerowe modele interakcji różnych układów do analizy aktywności leków. Charles DeLisi z Boston University i inni poszukują wsparcia dla programu Virtual Humań Project, futurystycznego przedsięwzięcia z dziedziny obliczeń rozproszonych, zakrojonego na skalę Projektu Poznania Ludzkiego Genomu. Być może więc któregoś dnia na pytania o szkodliwość fizyczną, chemiczną i biologiczną zamiast zwierząt będzie odpowiadać wirtualny człowiek.

Przekonać sceptyków

tworzenie alternatywnych metod nie jest jednak takie proste. Największym problemem jest zdobycie funduszy na badania zaprojektowane wyłącznie w tym celu, przynajmniej w Stanach Zjednoczonych. Choć federalny National Toxicology Program, koordynujący całość amerykańskich badań toksykologicznych, oraz National Institutcs of Envi-ronmental Health Sciences przyznają dotacje na rozwój tego rodzaju metod, a agencje rządowe oficjalnie wspierają humanitaryzację nauki, to w ostatnim dziesięcioleciu na walidację metod alternatywnych i ich upowszechnienie Stany Zjednoczone wydały niespełna 10 min dolarów. Dla porównania Unia Europejska w tym samym czasie przeznaczyła na ten cel 300 min euro, a poszczególne państwa członkowskie kolejne miliony - w samych Niemczech na poszukiwanie metod alternatywnych przeznaczono ponad 100 min euro. (Trzeba jednak przyznać, że Stany Zjednoczone i Unia Europejska wydają wiele milionów dolarów na badania, które mogą w przyszłości przyczynić się do opracowania takich metod).

Zanim nowa metoda alternatywna zostanie zaakceptowana przez instytucje rządowe, trzeba wykazać jej skuteczność. W Stanach Zjednoczonych proces walidacyjny nadzorowany jest przez Interagency Coordinating Committee on the Vali-dation of Alternative Methods (ICCVAM), którego członkami są przedstawiciele 15 agencji federalnych. ICCVAM powołuje niezależnych ekspertów, którzy na podstawie dostępnej literatury (w tym raportów dostarczanych przez firmy) mają ocenić, czy daną procedurę lub test można uznać za użyteczny. Ostateczna decyzja jest podejmowana przez każdą z agencji oddzielnie, w zależności od jej wewnętrznych przepisów. Od rozpoczęcia swojej działalności w roku 1997 ICCVAM dokonał oceny 16 metod alternatywnych, z czego sześć zostało zaakceptowanych, a do pozostałych 10 są wprowadzane poprawki zalecone przez ekspertów. Dawniej mijało nawet 10 lat, zanim procedura oceniona jako skuteczna wchodziła do powszechnego użytku; od czasu opracowania komitetu proces ten znacznie przyśpieszył.

W Europie proces weryfikacji metod alternatywnych jest oparty na podobnej zasadzie (i równie złożony) jak badania kliniczne nowych leków - należy przeprowadzić szczegółowe doświadczenia i dowód skuteczności leku lub metody oprzeć na faktach. Koncepcja naukowego programu walidacji metod alternatywnych zyskała powszechne poparcie na konferencji roboczej OECD w Solna w Szwecji w 1996 roku. European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM), będące częścią Joint Research Centre Unii Europejskiej, oraz ICCVA.M w zgodzie z tzw. Solna Principles prowadzą badania prewalidacyjne, mające ocenić wartość poszczególnych metod alternatywnych, a także wykazać ich braki. Jeżeli jakaś metoda zostanie wstępnie zaakceptowana. ECVAM zwykle organizuje sieć laboratoriów z różnych państw, które sprawdzają, jakie da ona wyniki dla zestawu substancji o znanym wpływie na organizm. Często w jednym laboratorium bada się równocześnie kilka metod alternatywnych - zastępników kon krotnego testu na zwierzętach. Rezultaty tych badań ocenia grupa złożona z. około 35 naukowców reprezentujących 25 państw członkowskich, Komisję Europejską, towarzystwa naukowe, przemysł i organizacje ochrony zwierząt (ICCYAM ma status obserwatora). Jeżeli okazuje się, że dana metoda alternatywna dobrze określa właściwości znanych substan cji, a wyniki jej zastosowania są spójne i udało sieje powtórzyć w różnych laboratoriach, ECVAM oficjalnie ogłasza je prawomocność.

r/ARZEC?C« ŚWIAT NAUKI 77