24077 SCAN0459

Obliczenia

Od absorbancji prób badanych odjąć absorbancję prób kontrolnych i z krzywej wzorcowej odczytać zawartość tyrozyny (wykres równania prostej pomiędzy punktami y(Abs.) = ax+b, czyli x(stężenie tyrozyny umol/ml) = y-b/a. R²-odchylenie). Gdy obliczymy x (stężenie tyrozyny trzeba uwzględnić rozcieńczenie i zrobić x 10 bo 10-krotne). Aktywność proteolityczną wyrazić w pmol tyrozyny/mg białka x 30 min.

Wyznaczyć równanie krzywej kalibracji.

Tyrozyna - Jest on aminokwasem endogennym, tzn. organizm ludzki (i ogólnie większości zwierząt) jest w stanie go syntetyzować pod warunkiem dostatecznego zaopatrzenia w fenyloalaninę, od której tyrozyna różni się tylko jedną grupą hydroksylową.

Odczynnik Folin-Ciocalteu - odczynnik ten stanowi mieszanina kwasu fosfowolframowego (H3PW12O40) i kwasu fosfomolibdenowego (H3PM012O40), które po utlenieniu fenoli ulegają redukcji do mieszaniny niebieskich tlenków wolframu (W₈0₂₃) i molibdenu (Mo₈0₂₃).

Pepsyna hydrolizuie wiązania peptydowe do krótszych polipeptydów i oligopeptydów. Enzym należący do klasy hydrolaz katalizujący hydrolizę wiązań peptydowych. P. jest endopeptydazą, tzn. wykazuje specyficzność do wiązań zlokalizowanych w środku łańcucha polipeptydowego. P. jest wydzielana przez gruczoły błony śluzowej żołądka w formie pepsynogenu, który pod wpływem niskiego pH ulega aktywacji do pepsyny. P. uczestniczy w trawieniu białek zawartych w pokarmie. Optimum pH dla pepsyny wynosi ok. 2. Pepsyna hydrolizuje wiązania za aminokwasami aromatycznymi.

Ćw. 2. Oznaczenie czystości preparatu enzymatycznego (pepsyny) metodą Lowry’ego Wykonanie

Część 1. Oznaczanie zawartości pepsyny

Do 1 ml badanej próby (pepsyny2) dodać 5 ml odczynnika C. Po dokładnym wymieszaniu, zawartość probówek pozostawić w temperaturze pokojowej na 10 min. Następnie dodać 0,5 ml odczynnika D. Po 30 min zmierzyć absorbancję przy długości fali 660 nm wobec próby odniesienia przygotowanej w analogiczny sposób jak próby badane, z tym że w miejsce roztworu białka dodać 1 ml wody. Próby badane wykonać w trzech powtórzeniach.

Część 2. Przygotowanie krzywej wzorcowej albuminy

Do probówek dodać kolejno 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 i 1 ml wzorcowego roztworu albuminy i uzupełnić woda do 1 ml. Równocześnie przygotować próbę odniesienia, która zamiast roztworu białka zawiera 1 ml wody destylowanej. Dalej postępować analogicznie jak w przypadku badanych prób. Wykreślić krzywą kalibracyjna w układzie absorbancji od ilości białka (oś x - stężenie albuminy w ml/mg/pmol, oś y -absorbancja).

Obliczenia:

Z krzywej wzorowej odczytać zawartość białka w rozcieńczonych próbach (rozcieńczenie było 1000 krotne, czyli x 100%), a następnie obliczyć ilość białka w całej masie nierozcieńczonego roztworu pepsyny (75mg).

Na podstawie uzyskanych wyników określić czystość preparatu pepsyny.

Stężenie białka = A(PB)/A(PW) x stężenie wzorca

W metodzie Lowry’ego (Lowry i wsp., 1951) ilościowego oznaczania białka wykorzystuje się czulą reakcję, jaką dają wiązania peptydowe i aminokwasy aromatyczne z odczynnikiem fenolowym Folina-Ciocalteu’a. Reakcja przebiega w dwóch etapach: pierwszy polega na przyłączeniu jonów miedzi do wiązań peptydowych, w drugim etapie następuje redukcja kwasu fosforowolframowego i fosforomolibdenowego do odpowiednich tlenków przez miedź związaną z białkiem oraz tyrozynę i tryptofan, zawarte w oznaczanym białku. Oznaczania ilościowego powstałych barwnych związków dokonuje się metodą spektrofotometryczną.

2