31737 skanuj0016

produkt (pmole) ~ czas (min)

Ryc. 1. Wzrost ilości produktu reakcji enzymatycznej w czasie

Odczynniki:

- jak przy wyznaczaniu optimum pH Wykonanie:

Do wyznaczenia szybkości początkowej reakcji katalizowanej przez kwaśną fosfatazę przygotowujemy 3-4 różne rozcieńczenia ekstraktu z ziemniaka (różne stężenie enzymu). Każda para przygotowuje jedno z wybranych rozcieńczeń ekstraktu, np. 10x, 50x, 100x lub 250x (ekstrakt należy rozcieńczyć 0,9% roztworem NaCl w kolbie miarowej) i wykonuje oznaczenie szybkości początkowej, dodając do mieszaniny reakcyjnej wyciąg o określonym rozcieńczeniu.

Do suchych probówek (próby wykonać w dwóch powtórzeniach') pipetujemy po 0,25 ml buforu octanowego o pH optymalnym dla aktywności fosfatazy kwaśnej i 0,25 ml roztworu substratu. Tak więc każda próba zawiera 0,5 ml mieszaniny inkubacyjnej o pH optymalnym dla fosfatazy kwaśnej. Próby umieszczamy w łaźni wodnej o temperaturze 37°C. Reakcję enzymatyczną rozpoczynamy dodając do każdej próby w odstępach co 30 sekund po 0,5 ml ekstraktu ziemniaczanego o odpowiednim rozcieńczeniu (10x, 50x, 100x lub 250x). Próby inkubujemy: 2, 4, 6, 8, 10 i 12 minut. Reakcję przerywamy dodając do probówek 5 ml 0,1M roztworu NaOH w odstępach 30-sekundowych (w tej samej kolejności jak dodawano enzym). Próby zerowe przygotowujemy pipetując do probówki 0,25 ml buforu o optymalnym pH oraz 0,25 ml p-nitrofenylofosforanu. Mieszaninę inkubujemy 12 minut w termostacie razem z próbami badanymi, po czym dodajemy 5 ml 0,1M roztworu NaOH i na koniec 0,5 ml enzymu o odpowiednim stężeniu. Dokonać pomiaru absorbancji przy długości fali X = 405 nm wobec próby zerowej.

Opracowanie wyników:

Na podstawie otrzymanych wyników dla każdego stężenia enzymu należy wykreślić zależność szybkości hydrolizy p-nitrofenylofosforanu (wyrażonej jako absorbancja przy 405 nm) od czasu inkubacji - poszczególne pary wymieniają się wynikami. Przedyskutować uzyskane wyniki! Dlacaego próby zerowe inkubujemy w łaźni wodnej bez enzymu?

7