Obraz4

Czas inkubacji (t)

Wyznaczanie szybkości początkowej (Vo) reakcji enzymatycznej:

a ( pmole)

Vo = tg a =    -

b (czas, min)

W wyniku hydrolizy sacharozy przez inwertazę, powstają równomolow^re ilości glukozy i fruktozy. Pomiar aktywności enzymu oparty jest na oznaczaniu ilości uwolnionych cukrów redukujących metodą z DNS.

W przypadku inwertazy przyrost produktów reakcji jest proporcjonalny do czasu inkubacji w zakresie co najmniej do 15 minut.

Dzięki temu wystarczy dokonać oznaczenia aktywności w tym przedziale czasu (standardowo - po 10 lub 15 min.) co znacznie upraszcza całe postępowanie.

2.4. Oznaczanie aktywności enzymatycznej:

a)    Rozcieńczyć preparat enzymatyczny do oznaczeń aktywności:

500x 1000 x 2500 x 5000 x (tzn. względne stężenie enzymu wynosi 1,0 0,5 0,2 i

0,1 )

b)    Oznaczanie aktywności enzymatycznej:

Przygotować 10 probówek ( dwie próby zerowe i po dwie próby dla każdego rozcieńczenia enzymu), do każdej napipetować:

♦    0,5 ml substratu (0.2 M sacharoza w buforze octanowym o pH 4,7) wstawić próby do łaźni wodnej o temp. 37°C, po wyrównaniu temperatury (po około 3 minutach) rozpocząć reakcję enzymatyczną dodając do poszczególnych par probówek po:

♦    0,5 ml odpowiednio rozcieńczonego enzymu (co 30 sekund). Inkubować próby 10 minut, po czym do każdej dodać po:

♦    2,0 ml odczy nnika DNS. Do prób zerowych dodać po 0,5 ml wody celem uzupełnienia objętości.

Wszystkie próby wymieszać i wstawić do łaźni wodnej o temp. 95° C na 10 minut. Ochłodzić próby pod bieżącą wodą i dokonać pomiaru foto metrycznego przy X = 540 nm wobec próby zerowej.

2.5 Oznaczanie białka w preparacie:

Rozcieńczyć preparat enzymatyczny 50 x (0,1 ml enzymu + 4,9 ml wody destylowanej).

4