20110407217

C Wyznaczanie szybkości początkowej reakcji

Wyznaczanie szybkości początkowej reakcji hydrolizy pNPP wykonujemy używając 10x, 50x, 100x f 250x rozaeńczeń wyciągu z ziemniaka (różne stężenie enzymu) - wyciąg należy rozcieńczyć 0,9% roztworem Nad do 25 ml.

1.    Do probówek wprowadzić po 0,25 ml buforu TriS'Octan o pH optymalnym dla aktywności kwaśnej fosfatazy (wyznaczonym w punkcie B) i 0,25 ml roztworu substratu. Próby wykonać w dwóch powtórzeniach.

2.    Próby wstawić do łaźni wodnej o temperaturze 30°C. Reakcję enzymatyczną rozpocząć dodając do każdej próby po 0,5 ml ekstraktu ziemniaczanego o odpowiednim rozcieńczeniu (10x, 50x, 100x lub 250x). Próby inkubować 2,4,6,8,10 i 12 minut.

3.    Reakcję zakończyć przez dodanie do każdej probówki po 5 ml 0,1M roztworu NaOH (w kolejności takiej jak dodawano enzym).

4.    Próby kontrolne (zerowe) należy przygotować w następujący sposób: do probówki wprowadzić 0,25 mi buforu o pH optymalnym dla aktywności fosfatazy kwaśnej (wyznaczonym w punkcie B) oraz 0,25 ml pNPP. Mieszaninę Inkubować 12 minut w łaźni wodnej razem z próbami badanymi, po czym dodać 5 ml 0,1M roztworu NaOH I na koniec 0,5 ml enzymu o danym rozcieńczeniu.

5.    Dokonać pomiaru absorbancji przy A-405 nm wobec próby kontrolnej (zerowej). Na podstawie otrzymanych wyników należy wykreślić zależność szybkości hydrolizy /> nłtrofenyłofosforanu (wyrażonej jako wartości absorbancji przy 405 nm) od czasu inkubacji, dla odpowiedniego rozcieńczenia enzymu.

Piśmiennictwo:

1.    Berg JM, Tymoczko, JL, Stryer l - Biochemia. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2005.

2.    Koolman J, Rohm K-H - Biochemia. Ilustrowany przewodnik. Wydawnictwo Lekarskie PZWL,

Warszawa 2005.