CCF20081011008

Wyznaczanie stałej Michaelisa K_m dla reakcji hydrolizy sacharozy przez

inwertazę z drożdży.

1. Odczynniki:

a/ 0,5 mg% roztwór inwertazy drożdżowej

b/ 6% roztwór sacharozy w 0,05 M buforze octanowym o pH 5,2 . Jest to roztwór podstawowy. Z tego roztworu należy sporządzić następujące rozcieńczenia, rozcieńczając go buforem (a nie wodą destylowaną!): 6%;    4%; 3%; 2%; 1%; 0,5%;

0,25% to znaczy:

4%    -10 cm sacharozy 6% + 5 cm buforu octanowego

-1    o

3%    - 5 cm sacharozy 6% + 5 cm buforu octanowego

•j    ->

2%    -    5    cm    sacharozy    4% + 5 cm buforu octanowego

-5

I    %    -    5    cm    sacharozy    2% + 5 cm buforu octanowego

0,5% - 5 cm^J sacharozy 1% + 5 cm^J buforu octanowego 0,25% - 5 cm^J sacharozy 0,5% + 5 cm^J buforu octanowego

c/ wzorcowy roztwór glukozy o stężeniu 10 mg%, z którego należy sporządzić wzorce o następujących stężeniach: 0 mg%, 5 mg% i 10mg% to znaczy rozlać do probówek:

0 mg% - 2 cm^J wody destylowanej

5 mg% - 1 cm^J wody destylowanej + 1 cm^J glukozy 10 mg%

10 mg% - 2 cm³ glukozy 10 mg% d/ odczynniki do metody Somogyi - Nelsona 1 - odczynnik miedziowy

II    - odczynnik arseno-molibdenowy

Wykonanie:

	1	2	3	4	5	6	7
próby kontrol.	0,25%	0,5%	1%	2%	3%	4%	6%
próby właśc.	0,25%	0,5%	1%	2%	3%	4%	6%

Zaczynając od najniższego stężenia odmierzyć do dwóch probówek po 1 cm^J 0,25% roztworu sacharozy, do następnych dwóch po 1 cm’’ 0,5% sacharozy, itd. Jedna probówka z każdego stężenia będzie próbą właściwą, a druga kontrolą wg. schematu:_

Próby właściwe wstawić do łaźni wodnej o temperaturze 30°C (+- 0,1 °C) na ok. 10 minut w celu dogrzania do 30°C. Następnie dodawać do nich w odstępach 1 minutowych (ze stoperem ) po 1 cm^J roztworu enzymu - inwertazy, wymieszać przez wstrząsanie i inkubować przez dokładnie 15 minut w łaźni wodnej o temp. 30°C. Reakcję przerwać dodając po 2 cm^J miedziowego odczynnika Somogyi, wyjąć probówki z łaźni i wymieszać.

Do serii kontrolnej dodawać najpierw' 2 cm’ miedziowego odczynnika Somogyi a później 1 cm^J roztworu enzymu i dobrze wymieszać. Inkubacja przez 15 minut nie jest tu potrzebna.

Do wzorców glukozy należy także dodać po 2 cm³ odczynnika Somogyi.

Oznaczanie cukrów redukujących metoda Somogyi - Nelsona

Ustawić na statywie metalowym probówki z próbami właściwymi, kontrolnymi i wzorcami glukozy. Wstawić statyw na wrzącą łaźnię wodną i gotować przez 10 minut (stoper). Po ostudzeniu dodawać po 2 cm³ odczynnika arseno-molibdenowego, intensywnie wstrząsając probówki aż do całkowitego rozpuszczenia osadu i wypienienia roztworu.

2