CCF20081011008 (3)

Wyznaczanie stałej Michaelisa K_m dla reakcji hydrolizy sacharozy przez inwertazę z drożdży.

1. Odczynniki:

a/ 0,5 mg% roztwór inwertazy drożdżowej

b/ 6% roztwór sacharozy w 0,05 M buforze octanowym o pH 5,2 . Jest to roztwór podstawowy. Z tego roztworu należy sporządzić następujące rozcieńczenia, rozcieńczając go buforem (a nie wodą destylowaną!): 6%;    4%; 3%; 2%; 1%; 0,5%;

0,25% to znaczy:

- 10 cm³ sacharozy 6% + 5 cm^J buforu octanowego

4%

-    5 cm sacharozy 6% + 5 cm buforu octanowego

o    ą

-    5 cm sacharozy 4% + 5 cm buforu octanowego

3    3

- 5 cm sacharozy 2% + 5 cm buforu octanowego

- 5 cm sacharozy 1% + 5 cm buforu octanowego

”3    "D    ~~

5 cm sacharozy 0,5% + 5 cm buforu octanowego

3%

2%

1%

0,5%

0,25%

c/ wzorcowy roztwór glukozy o stężeniu 10 mg%, z którego należy sporządzić wzorce o następujących stężeniach: 0 mg%, 5 mg% i 10mg% to znaczy rozlać do probówek:

0 mg% - 2 cm³ wody destylowanej

5 mg% - 1 cm^J wody destylowanej + 1 cm³ glukozy 10 mg%

10    mg% - 2 cm³ glukozy 10 mg% d/ odczynniki do metody Somogyi - Nelsona

I - odczynnik miedziowy

11    - odczynnik arseno-molibdenowy

Wykonanie:

Zaczynając od najniższego stężenia odmierzyć do dwóch probówek po 1 cm^J 0,25% roztworu sacharozy, do następnych dwóch po 1 cm^J 0,5% sacharozy, itd. Jedna probówka z każdego

	1	2		o 3	4	5	6	7
próby kontro 1.	0,25%	0,5%		i%	2%	3%	4%	6%
próby właśc.	0,25%	0,5%		i%	2%	3%	4%	6%

Próby właściwe wstawić do łaźni wodnej o temperaturze 30°C (+- 0,1 °C) na ok. 10 minut w celu dogrzania do 30°C. Następnie dodawać do nich w odstępach 1 minutowych (ze stoperem ) po 1 cm³ roztworu enzymu - inwertazy, wymieszać przez wstrząsanie i inkubować przez dokładnie 15 minut w łaźni wodnej o temp. 30°C. Reakcję przerwać dodając po 2 cm³ miedziowego odczynnika Somogyi, wyjąć probówki z łaźni i wymieszać.

Do serii kontrolnej dodawać najpierw 2 cm^J miedziowego odczynnika Somogyi a później 1 cm^J roztworu enzymu i dobrze wymieszać. Inkubacja przez 15 minut nie jest tu potrzebna.

Do wzorców glukozy należy także dodać po 2 cm³ odczynnika Somogyi.

Oznaczanie cukrów redukujących metoda Somogyi - Nelsona

Ustawić na statywie metalowym probówki z próbami właściwymi, kontrolnymi i wzorcami glukozy. Wstawić statyw na wrzącą łaźnię wodną i gotować przez 10 minut (stoper). Po ostudzeniu dodawać po 2 cm³ odczynnika arseno-molibdenowego, intensywnie wstrząsając probówki aż do całkowitego rozpuszczenia osadu i wypienienia roztworu.

2