73798 skanuj0015

probówek (za wyjątkiem prób „O”) po 0,5 ml rozcieńczonego enzymu. Reakcję hydrolizy enzymatycznej przerwij po 15 min. inkubacji dodając do każdej probówki (również do prób „0”), po 5 ml 0,1 M NaOH, zachowując analogiczną kolejność i odstęp czasu między próbami do tych, w jakich dodawałeś enzym. Następnie do każdej próby „0” dodaj 0,5 ml rozcieńczonego enzymu. Wymieszaj i zmierz absorbancję przy długości fali A. = 405 nm. Współczynnik kalibracji dla p-nitrofenolu = 156,3 nmoli/na próbę.

Oznaczanie białka metodą Bradford:

Do 0,lml 50x rozcieńczonego enzymu dodaj 2 ml odczynnika Bradford. Po 5 minutach zmierz absorbancję przy długości fali X =595 nm względem próby „0”, do której zamiast enzymu dodaj 0,lml 0,9% NaCl. Analizę wykonaj w 3 powtórzeniach. Współczynnik kalibracji = 0,37 mg/ml

Opracowanie wyników:

Przedstaw na wykresie zależność aktywności enzymu od pH. Odczytaj z wykresu pH optymalne dla aktywności fosfatazy kwaśnej ziemniaka. Oblicz aktywność właściwą enzymu.

Zadania rachunkowe:

1.    Oblicz pH następujących roztworów: a/ 0,1M HC1; b/ 0,1M KOH; c/ lOmM HC1; d/ 50mM H2SO4

2.    Jakie jest pK_k kwasu bursztynowego, jeśli stałe dysocjacji Ki = 6,4 x 10'⁵ a K₂ = 2,7xł0"⁶?

3.    Oblicz stężenie jonów wodorowych we krwi w pH 7,42. Jakie pH będzie w kwasicy, jeśli stężenie jonów wzrośnie dwukrotnie?

4.    Roztwór uzyskany przez rozpuszczenie benzoesanu sodu i kwasu benzoesowego w wodzie żSSaiia po 9 mmoli każdego z nich; mieszanina ma pH = 4,21 (25°C). Oblicz stałą

kwasu benzoesowego.

potrzebna ilość gl^W^pipido p^goto^^feil litra 0,1M buforu o ’ ■$mMWpa3- Wartość pH< karbjjj^g^tij^cgrup glicyny = 2,4.

III. Wyznaczanie szybkości początkowej reakcji

Przy    enzymu i substrattt ś^P^ć powstawania produktu »feji (pmol

pti^M/min) powinna być wprost proporcjonalna do czasu reakcji. W rzeczywis§a|ęi tylko pjezątferwtsj fażie reakcja ta jest reakcją psiego rzędu (Ryc. 1), a szybko^tdziałania enzymu, ||||,^| liniową funkcji mii nazywamy szybkością początkową reakcji enzymatycznej (Vo).

Dla badań kinetyki enzymów niezwykli    więc określenie przedziału czasu reakcji,

w którym przyrost produktu reakcji ezymatycznej jest wprost proporcjonalny do czasu. W analizaeh B; viiró stężenie substratu maleje w czasie reakcji i po dłuższym czasie inkubacji ZateBtóść między przyrostem produktu a czasem nie będzie funkcją liniową (Ryc. 1). W warunkach eksperymentu róiiś^eż enzym m<W ulegać denaturacji, co pogłębia powyższy -efóf, Wartość V₀ uzyskuje ag przez wykreślenie linii prostej stycznej do początkowe® si®fe8'S^g^J>oczynająjeę0i^: czasu jpastei (Ryc. l).,Nachylenie|;|g pas^ma wartośl

M.

6