W osadzie czynnym podstawową rolę odgrywa zróżnicowany zespół organizmów, powiązanych ze sobą. W skład osadu wchodzą:
- bakterie właściwe
- organizmy nitkowate: promieniowce, grzyby, bakterie nitkowate
- pierwotniaki — w szczególności orzęski, wiciowce i korzenionórzki.
- zwierzęta wielokomórkowe — w szczególności wrotki, nicienie.
Bakterie właściwe: należą do najliczniej występujących mikroorganizmów osadu czynnego. W lg suchej masy osadu czynnego liczba komórek bakterii osiąga wartość 109- 1012. Są podstawą procesów metabolicznych przebiegających podczas oczyszczania ścieków. Wśród nich występują zarówno organizmy heterotroficzne, hemoautotroficzne, saprofityczne, jak i chorobotwórcze. Do najczęściej spotykanych rodzajów należą Pseudomonas, Nitrosomonas, Azotobacter, Chromobacterium, Micrococcus. Szczególną rolę w osadzie czynnym przypisuje się bakteriom zooglealnym w związku z wydzielaniem śluzu, który jak stwierdzono wywołuje wiązanie substancji koloidalnych, zawiesin i komórek bakteryjnych. Przypuszcza się, że jest to jeden z podstawowych sposobów tworzenia się kłaczków.
Organizmy nitkowate: promieniowce, grzyby, bakterie nitkowate. Bakterie nitkowate znajdujemy prawie w każdym osadzie czynnym. Należą one do naturalnej populacji osadu. Nadmierny rozwój tych mikroorganizmów (promieniowce, grzyby, bakterie nitkowate) doprowadzić jednak może do tzw. puchnięcia osadu czynnego, co prowadzi do przerwania jego kontaktu z substancjami ściekowymi, wskutek czego procesy biochemiczne są zahamowane, a sedymentacja zawiesin jest utrudniona.
Pierwotniaki: najczęściej spotykane są orzęski, wiciowce i korzeilionórzki. Zmiany w proporcjach ilościowych poszczególnych grup pierwotniaków informują nas o zaburzeniach w równowadze biocenotycznej, a tym samym i złej pracy osadu czynnego. Szczególna rolę w osadzie czynnym odgrywają orzęski, które jako konsumenci bakterii przyczyniają się do odmładzania populacji bakteryjnej, przez co uzyskuje się w sposób ciągły najwyższą wydajność procesów biochemicznych. Tworzące się nowe populacje bakteryjne zużywają bez przerwy substancje organiczne, aż do ich wyczerpania. Orzęski wpływają również na wielkość kłaczków, nie dopuszczają do ich nadmiernego rozrostu. Jako organizmy, u których stwierdzono możliwość wytwarzania śluzu egzocelulamego, przyczyniać się mogą, podobnie jak bakterie zooglealne, do tworzenia kłaczków.
Zwierzęta wielokomórkowe: do najczęściej spotykanych tkankowców należą nicienie i wrotki. Główna rola tych organizmów polega na wyżeraniu mniejszych pierwotniaków i bakterii, co pozwala na ciągłe odmładzanie tych populacji i nie dopuszcza do ich rozrostu.