25

Ćwiczenie 2._

Fotometryczne oznaczanie zawartości białka')

Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest poznanie zasad, na których oparte są ważniejsze metody oznaczania białka związanych z cechami jego budowy. Celem równoległym jest zapoznanie się, na przykładzie metody Lowryjego i współpracowników, z fotometryczną analizą ilościową często wykorzystywaną w badaniach biochemicznych. Metoda ta może być zastosowana np. do oznaczania białka w mleku.

Wprowadzenie

Metody oznaczania zawartości białka oparte są na charakterystycznych cechach jego budowy'. Najczęściej wykorzystywane są następujące cechy białek;

1)    obecność azotu w składzie pierwiastkowym,

2)    obecność reszt aminokwasów' aromatycznych (fenyloalaniny, tyrozyny, tryptofanu) w składzie aminokwasowym,

3)    występowanie wiązań peptydowych,

4)    występowanie wolnych grup aminowych.

Zostaną omówione następujące ważniejsze metody oznaczania białka:

a)    oznaczanie azotu białkowego metodą Kjeldahla,

b)    metody fotometryczne.

^v i

a. Oznaczanie azotu białkowego metodą Kjekłahla \\^^v

W metodach oznaczania białka na podstawie obecności azotu wykorzystuje się fakt, że zawartość tego pierwiastka w poszczególnych białkach jest stała i wynosi dla różnych białek od 15% do 19%, a zależy głównie od częstotliwości występowania aminokwasów zasadowych. Dlatego pomnożenie wartości oznaczonego azotu przez odpowiedni przelicznik prowadzi do określenia ilości białka w próbie. Większość białek zwierzęcych zawiera ok. 16% azotu i dlatego przelicznik dla nich wynosi 6,25 (100:16 =6,25%). Natomiast białka roślinne zawierają powyżej 16% azotu i przy obliczaniu ilości tych białek stosuje się przelicznik od 5,5 do 6,0. Ponieważ białkom w' materiale biologicznym towarzyszą inne związki azotowe, takie jak: kwasy nukleinowe, aminokwasy, amidy, niskocząsteczkowe peptydy i związki mineralne, w których zawartość azotu nie przekracza zwykle 6% azotu ogólnego, dlatego często w analizach technicznych oznacza się tzw. azot ogólny i na podstawie tej wartości oblicza się tzw. białko ogólne.

W bardziej precyzyjnych analizach natomiast oznacza się tylko azot występujący w białkach. Aby takie oznaczenie przeprowadzić, należy białko oddzielić od związków niebiał-kowych, stosując wytrącanie białek z badanego roztworu za pomocą kwasu, np. trichlorooc-

¹'‘Opracowanie praktyczne —zespół, opracowanie teoretyczne — dr Jerzy Rogoziński.

16