28

Wzór A = logy = log I₀ -log I pozwala przeliczyć transmisję na absorbancję. Ponieważ

wartość I_a (światła padającego) w jednostkach transmisji (T) wynosi 100, a log 100 = 2, więc A - 2 -log L Przeliczenie jednostki transmisji na jednostki absorbancji przedstawiono w tabeli na końcu skryptu.

W metodzie fotometrycznej pomiar polega na bezpośrednim odczycie transmisji lub absorbancji warstwy badanego roztworu o stałej grubości. W tych w^rarunkach stężenie sub-

stanq'i jest wprost proporcjonalne do absorbanq'i, czyli A = logy = k • c. Zamiast stosowania molowego współczynnika absorbancji k na ogół jest wygodniej wykreślić tzw. krzywą wzorcową dla oznaczanej substancji. Wykreśla sięjąodkła dając na osi rzędnych wartość absorbancji lub transmisji kilku różnych znanych stężeń badanego związku, a na osi odciętych odpowiadające im stężenia substancji Krzywe wzorcowe wyrażone w wartościach absorbancji powinny mieć kształt linii prostej, natomiast wyrażone w wartościach transmisji mają postać krzywej logarytmicznej.

Pomiary fotometryczne dokonywane są za pomocą fotometrów lub spektrofotometrów wyposażonych w tzw. fotoogniwa lub fotokomórki które służą do pomiarów natężenia światła przechodzącego przez roztwór pochłaniający (badany) oraz przez próbę odniesienia (najczę-ściej czysty rozpuszczalnik). Pomiar próby odniesienia (kontrolnej) zwykle służy do wyzerowania przyrządu, gdyż nastawia się go według tej próby na 100% transmisji lub 0 w wypadku pomiaru absorbancji. Przyrządy są wyskalowane na pomiar absorbancji lub transmisji (albo zawierają obie skale równocześnie), a wskazań dokonuje sprzężony z tą skalą miernik.

~    . Spektrofotometryczna metoda oznaczania białka. Większość związków aromatycznych

ma zdolność pochłaniania światła nadfioletowego o długości fali 280 nm. Obecność reszt aminokwasów' aromatycznych w białkach nadaje ich roztworom tę zdolność, co jest wykorzystywane jako podstawa spektrofotometrycznej metody ich oznaczania. Efektem pochłaniania światła przechodzącego przez roztwór jest jego częściowe wygaszenie, którego miarą jest absorbancja, przy czym wartość jej zależy od stężenia związku pochłaniającego. Dlatego wyznaczając odpowiedni dla danego białka współczynnik przeliczeniowy, można wartość absorbancji, mierzoną w ściśle określonych warunkach, przeliczyć w przybliżeniu na ilość białka. Stosując tę metodę można oznaczyć w próbie białko o stężeniu od 10 pg.

Zaletami metody są: łatwość i szybkość wykonania oznaczenia, co ma szczególne znaczenie w preparatyce enzymatycznej. Wadąjest natomiast niezbyt duża dokładność oznaczenia wynikająca z pomiaru w białku reszt aminokwasów aromatycznych, których zawartość w różnych białkach jest niejednakowa. Również obecność w wyciągach surowych niebiałko-wych związków aromatycznych pochłaniających światło w podobnym zakresie zmniejsza :ę

dokładność.    ...... .____

i Metoda z udziałem błękitu bryiautowego Coomassie według Sedmaka i Grossberga. Jest to czuła i szybka metoda, która polega na reakcji wolnych grup NH| reszt aminokwasowi, w białkach z formą anionową błękitu brylantowego Coomassie 250-G w środowisku kwaśnym. Forma anionowa barwnika ma zabarwienie brązowopomarańczowe, natomiast w poła-