45 (8)

4a. Preparat wypłukuje się w 0,01 M PBS (buforowany fosforanami roztwór fizjologiczny soli) o pH 7.5. w celu usunięcia tej części koniugatu. która nic uległa związaniu z antygenem. Stosuje się różne sposoby spłukiwania, od jednorazowego zanurzenia w PBS do wielokrotnych zmian PBS, co pól godziny, a nawet dłużej. Zależy to przede wszystkim od grubości preparatu, stężenia barwnika i ilości PBS na jedno płukanie.

5a. Na preparat nanosi się glicerol buforowany (90% glicerolu i 10% PBS o pH 7,5) i nakrywa szkiełkiem. Do oglądania pod immersją zalecany jest olejek o słabej fluorcsccncji.

Przy metodzie pośredniej (b):

3b. Na utrwalony (jak poprzednio) preparat nanosi się nie znakowane przeciwciała (gammaglobuliny) przeciw poszukiwanemu wirusowi i preparat trzyma w temperaturze 37 C przez 30 minut.

4b. Spłukuje się nie związane przeciwciała.

5b. Nanosi sie koniugat zawierający przeciwciała skierowane przeciw gammaglobulinom lego gatunku zwierzęcia, które było użyte do sporządzenia przeciwciał nie znakowanych, naniesionych na preparat w punkcie 3b. Jeżeli na przykład użyto w punkcie 3b. przeciwwirusowe przeciwciała wyprodukowane na kurach, to w punkcie 5b. stosuje sie znakowane fluorochromem przeciwciała dla globulin kury. Czas barwienia tym koniugatem, jak przy metodzie bezpośredniej.

ób. Preparat oplukuje się w celu usunięcia nie związanych znakowanych przeciwciał, nakrapla buforowany glicerol, nakrywa szkiełkiem i bada w mikroskopie fluorescencyjnym.

Dodatni wynik odczynu w obu metodach wyraża się świeceniem tych miejsc, gdzie został związany koniugat.

Równocześnie z próbą właściwą wykonuje się następujące kontrole swoistości koniugatu (cyt. wg Spcndlovc'a):

a)    hamowanie swoistego barwienia (świecenia) przez nic znakowane przeciwciało,

b)    zmniejszenie intensywności świecenia po uprzednim dodaniu homologicznego antygenu do koniugatu,

c)    brak świecenia po barwieniu koniugatem, normalnych, nie zakażonych tkanek lub tkanek zakażonych innym, gatunkowo niespokrew-nionym antygenem,

d)    brak świecenia zakażonych tkanek po barwieniu ich koniugatami sporządzonymi z surowic przed uodpornieniem lub /. heterologicznych surowic odpornościowych.

Dla uproszczenia i skrócenia czasu rozpoznawania można stosować w pośrednim odczynie IF mieszaninę przeciwciał dla kilku wirusów. W badaniach zakażeń wirusowych narządu oddechowego ludzi wykazano możliwość równoczesnego użycia 9 surowic.

Odczyn immurcoperokjiydazowy (IP)

Istota metody jest la sama co w odczynie IF, z tym, że koniugat stanowią swoiste przeciwciała znakowane enzymem peroksydazą chrzanową. Jest to więc odczyn immunocnzyniatyczny. Dużą jego zaletą w rutynowej pracy rozpoznawczej jest to, że preparaty można oglądać w zwykłym mikroskopie.

Podobnie jak w odczynie IF. także tutaj są stosowane dwie metody. Przy metodzie bezpośredniej stosuje się koniugat przeciw wirusowy, przy pośredniej koniugat przeciw gammaglobulinom, które związały sic z antygenem w pierwszej fazie reakcji. Znakowanie przeciwciał peroksydazą (sporządzenie koniugatu) wykonuje się najczęściej metodą podaną przez Avramcasa. Jest ona stosunkowo prosta, jednak z powodów omówionych już przy odczynie IF, wskazane jest używanie handlowych koniugat.

Wykonanie odczynu (cyt. wg Kurslaka). W przypadku badania jednowarstwowych hodowli komórek zakażonych wirusem postępowanie jest następujące.

1.    Opłukać komórki (na szkiełkach nakrywkowych) w PBS i utrwalić je w temperaturze pokojowej jak w odczynie immunofluorescencji — najczęściej stosuje się albo 95% etanol przez 30 minut, albo aceton przez 10 minut.

2.    Preparaty osuszyć na powietrzu, pokryć komórki 2- -3 kroplami koniugatu peroksydazowego (przeciwciała znaczone peroksydazą chrzanową) i umieścić w komorze wilgotnej w 37^CC na 30 minut (niekiedy lepiej przedłużyć ten czas inkubowania do 1—2 godzin w 37X lub do 12 godzin w 4°C).

3.    Preparat płukać 3 razy po 10 minut w PBS i jeden raz przez 5 minut w wodzie destylowanej, a następnie osuszyć na powietrzu.

4.    Na preparat nanieść kilka kropel odczynnika bcuzydynowego do wykrywania peroksydazy (patrz dalej).

5.    Po 5—10 minutach preparat przepłukać krótko w PBS. zatopić i oglądać w zwykłym mikroskopie optycznym.

45