4

Plazmid działa jak wektor do klonowania - przez repl^;kację umo2liwia namnożę: =• sklonowanego genu w komórce gospodarza. Plazmidy reDlikują się z duża wydajnością komórkach b3kteryjnych_r ponieważ każdy plazmid ma sekwencję miejsca stanu replikas. {en) rozpoznawaną przez polimerazy DNA i inne iałka. które normalnie repliku "ą chromosomy bakterii. Maszyneria 'aplikacyjna komórki gospodarza namnaża zatem plazmid wraz z wszelkimi nowymi genami, które zostały do nich wstawione.

Plazmidy sa rzadkie u eukariontów, chociaż Saccharomyces cerevisese mz któr. czasem wykorzystuje się do klonowania; większość wektorów używanych w komórkac^-eukariotycznych opiera się na genomach wirusowych.

Do najbardziej popularnych wektorów plazmidowych należy    Jest małym

piazmidem i zawiera dwa geny:

-    gen odporności na ampicylinę - bakteria zawierająca pUC8 ma zdolność syntezy enzymu zwanego p-laktamozą, który pozwala komórce przeciwstawić się hamującemu wzrost wpływowi antybiotyku. Odporność na ampicylinę jest zatem markerem selekcyjnym plazmidu pUC8

-    gen Iac2. kodujący część enzymu p-galaktozydazy

Czysty DNA pUC8 można otrzymać dość łatwo z ekstraktów komórek bakteryjnych i po manipulacji plazmidy można ponownie wprowadzić do E.coli przez transformację, proces v/ którym „nagi" DNA jest pobierany przez komórkę bakteryjną.

Istotne w odróżnieniu plazmidu będącego rekombinantem od niezrekombinowanego >ns: to. że ligacja nowego DNA w którekolwiek z tych miejsc proawdzi do inaktywacji genu przez insercję - utraty aktywności |3 - galaktozydazy.

a) techniczne aspekty klonowania

ekstrakt komórkowy RNA, ONA, białko

wirowanie

fenol

naćsącz przenoszony do nowej probówki

OczySZCźonic DNA : eksi komórkowego przez de gra usuniecie wszystkich ir składników

S?,

osad komórkowy

etanol

faza wodna DNA i KNA

wirowanie

wytrącony DN 4

fazn wodne ptzenoszor.s do probówki, inkubacjo z rybonokleszą

granica faz (wytrącone białka)

frnnl