8

\

\

. wC'

gondii. Dąży się w niej do amplifikacji materiału genetycznego. W tym celu wykorzystuje^-' się parę syntetycznych oligonukleotydów o sekwencjach komplementarnych do fragmentu poszukiwanego DNA, tzw. primerów (starterów) reakcji oraz termooporną polimerazę Taq. Najważniejsze w metodzie jest uzyskanie zwiększonej ilości DNA przed dalszą analizą.

Fazy metody:

1.    Denaturacja DNA - w 92 - 96°C prowadząca do pękania wiązań wodorowych.

2.    Przyłączenie startera (krótki fragment o znanej sekwencji) do komplementarnej sekwencji końców matrycy DNA, który będzie ulegał amplifikacji (temperatura ok. 45-55°C).

3.    Synteza fragmentu DNA z udziałem polimerazy Taq (z bakterii Thermus aąuaticus), trifosforanów (dNTP) i jonów magnezu w temperaturze 70-75°C.

Etapy trwają łącznie 3-4 minuty i nazywane są cyklem. Proces prowadzi się w tzw. teremocyklerach, które są w pełni zautomatyzowane. Wyniki uzyskuje się już po kilku godzinach. g^Sscykli powiększa zawartość kwasu około miliona razy. Otrzymany DNA ma wielkość określoną przez zastosowaną parę starterów. Do identyfikacji uzyskanego w takiej ilości kwasu wykorzystuje się sondę genetyczną lub metodę rozdziału elektroforetycznego produktu amplifikacji w żelu agarozowym.

V W diagnostyce molekularnej do rozróżniania gatunków i ich szczepów najczęściej wykorzystuje się sekwencje komplementarne do DNA kodującego rRNA. Regiony te zawierają wielokrotnie powtórzone sekwencje zgrupowane w zespoły, co ułatwia ich wykrycie nawet przy niewielkiej ilości badanego materiału. Wykazują one przy tym stabilność wewnątrzgatunkową i bardzo duże zróżnicowanie międzygatunkowc. Niekiedy wykorzystuje się również genom mitochondrialny wykazujący większą zmienność niż jądrowy. DNA pochodzi najczęściej z krwi lub kalii. Można pozyskiwać go również z płynu mózgowo-rdzeniowego i owodniowego, gałki oka, cienkoiglowych bioptatów tkankowych czy popłuczyn oskrzelowych.

Metody genetyczne szczególnie przydatne są:

1.    Gdy pasożyty lokalizują się poza przewodem pokarmowym i układem krwionośnym.

2.    W diagnostyce inwazji larw zatrzymanych w rozwoju.

3.    W różnicowaniu gatunków, których jaja i larwy są nieodróżnialne metodami klasycznymi.

4.    Przy niskiej intensywności inwazji.

5.    W przypadku niemożliwości hodowli pasożytów.

6.    Gdy badania immunologiczne są niewystarczające lub niemożliwe do wykonania.

W Polsce metody biologii molekularnej mają zastosowanie w przypadku Entamoeba histolytica,. Plasmodium spp., Toxoplasmci gondii, Cryptosporidium spp., mikrosporydiów (np. Encephalitozoon spp.), Echinococcus multilocularis, Trichinella spp. i patogenów przenoszonych przez kleszcze (Babesia spp., Anaplosma spp., Borrelia spp.).

22