DSC00157 (25)

kroplami stężony HCI. W obecności metioniny pojawia się różowe zabarwienie.

3. Rozdział mieszaniny aminokwasów

metodą chromatografii bibułowej techniką Matthiasa

Chromatografia bibułowa jest jedną z odmian chromatografii podziałowej w układzie ciecz-ciecz. Fazę stacjonarną stanowi woda jako rozpuszczalnik polarny, a fazę ruchomą - niepolarny rozpuszczalnik organiczny. Bibuła spełnia rolę nośnika.

Proces chromatografii podziałowej polega na rozdzieleniu składników mieszaniny pomiędzy układ niecałkowicie mieszających się rozpuszczalników. Funkcje nośnika spełniać mogą żele krzemionkowe, bibuła, tlenek glinu czy celuloza w proszku.

Podczas rozdziału mieszaniny na składniki działają dwie siły przeciwnie skierowane. Siłą przyspieszającą jest ruch fazy ruchomej oraz składników mieszaniny w niej rozpuszczonych. Siłę hamującą stanowi adsorpcja, zmniejszająca szybkość wędrówki składników mieszaniny w fazie ruchomej. W zależności od stopnia podziału tych składników między fazę stacjonarną i ruchomą wędrują one z różną szybkością. Zależności te określa współczynnik podziału a, który można wyrazić wzorem:

gdzie:

c,    - stężenie składnika w fazie ruchomej,

c₂    - stężenie składnika w fazie stacjonarnej.

Wartości, jakie może osiągnąć współczynnik, zawarte są w granicach od 0 do 1.

Chromatografia bibułowa stanowi technikę cząsto stosowaną w badaniach biochemicznych. Jest to metoda prosta i szybka, nie wymaga zbyt dużych ilości substancji, której skład chcemy zbadać. Do chromatografii wykorzystuje się bibuły filtracyjne wyprodukowane z wysoko oczyszczonej celulozy, które różnią się grubością i porowatością. Najczęściej stosowana jest bibuła Whatmana.

Rozróżnia się następujące techniki chromatografii bibułowej:

• jednokierunkowa - układ rozwijający przepływa w jednym kierunku, jego wędrówka może odbywać się z góry w dół (mówimy wtedy o technice spływowej lub zstępującej) lub z dołu do góry (technika wstępująca), albo poziomo (taką technikę stosuje się w chromatografii krążkowej);

I dwukierunkowa i układ rozwijający rozwija się w jednym kierunku, suszy i rozwija w drugim kierunku; zwykle stosuje się inne układy rozpuszczalników;

I zależnie od kształtu bibuły rozróżnia się technikę arkuszową, paskową i krążkową.

Opracowano wiele wariantów układów rozwijających służących do rozdziału aminokwasów. Ich głównymi składnikami są — obok wody - fenole, alkohole i zasady pirydynowe. Mogą to być układy dwu- lub trójskładnikowe, czasami liczba składników jest większa. Wykorzystuje się zasadę łączenia składników polarnych i niepolarnych. Często stosuje się zakwaszanie mieszanin rozwijających kwasem octowym, mrówkowym, propionowym albo solnym, lub też alkalizację amoniakiem.

Rozwijanie chromatogramu prowadzi się zwykle do czasu, kiedy front rozpuszczalnika zbliży się do przeciwnego końca bibuły. Po wyjęciu z komory zaznacza się linię, jaką osiągnął rozpuszczalnik, i wywołuje chromatogram. Polega to najczęściej na reakcji barwnej, jaka zachodzi pomiędzy składnikami mieszaniny rozdzielanej a odpowiednimi odczynnikami, którymi spryskuje się chromatogram. W tym celu chromatogram wyjęty z komory, na którym zaznaczono „czoło" rozpuszczalnika, suszy się i wywołuje przez spryskanie odpowiednimi odczynnikami. Do wywołania chromatogramów aminokwasów używa się najcząściej roztworu ninhydryny lub izatyny.

Po wywołaniu chromatogramu oblicza się współczynnik R,-, charakteryzujący szybkość wędrówki danego składnika rozdzielanej mieszaniny:

o _ odległość od linii startu do środka plamki_

^f odległość od linii startu do frontu rozpuszczalnika

Wartość R_f zależy od wielu czynników: rodzaju bibuły, nasycenia komory parami rozpuszczalnika, temperatury rozdziału i obecności innych substancji.

153