22214

O Żele agarozowe o różnym stężeniu stosuje się do rozdziału fragmentów DNA od 200 pz do 50 000 pz

•    Detekcja kwasów nukleinowych w agarozie:

o Barwniki fluerescencyjne - np. lub bromek etydyny pozwalają na uwidocznienie makrocząsteczek po zakończeniu elektroforezy lub wybarwienie przed separacją. Znaczniki uwidaczniają położenie prążków w świetle UV lub widzialnym. Czułość detekcji jest porównywalna z barwieniem srebrem lub jest nieco lepsza.

IMMUNOELEKTROFOREZA BIAŁEK NA ŻELACH AGAROZOWYCH:

Metody wykorzystujące swoiste reakcje Ag-lg

•    Elektroforeza białek i immunodyfuzja Ig - linie precypitacyjne charakterystyczne dla reakcji Ag-lg

•    Immunoelektroforeza rakietowa - elektroforeza w agarozie z dodatkiem Ag

•    Immunoelektroforeza krzyżowa - kombinacja zwykłej elektroforezy na żelu agarozowym i elektroforezy rakietowej

IMMUNOELEKTROFOREZA - zależy od specyficznych reakcji antygen-przeciwciało i służy do detekcji rozdzielonych białek. Po niskonapięciowej elektroforezie próbek na żelu agarozowym wprowadza się surowice odpornościowe, które dyfundują przez żel i tworzą widoczne osady z rozdzielonymi antygenami.

Elektroforeza na ŻELU POLIAKRYLAMIDOWYM:

•    polimer akrylamidu i bisakrylamidu (czynnik sieciujący)

•    posiada wysoką zdolność rozdzielczą

•    odporny na działanie czynników chemicznych

•    przezroczysty, bezbarwny, sprężysty

•    zapewnia powtarzalność rozdziałów

•    Elektroforeza kwasów nukleinowych odbywa się zazwyczaj w układzie pionowym

Elektroforeza w żelach poliakrylamidowych stosowana w biologii molekularnej do analizy małych cząsteczek kwasów nukleinowych.

Detekcja kwasów nukleinowych w żelach poliakrylamidowych:

•    Barwienie srebrem:

o Utrwalanie żelu o Barwienie azotanem srebra o Odbarwianie tła

ELEKTROFOREZA BIAŁEK W ŻELU POLIAKRYLAMIDOWYM:

•    Elektroforeza natywna -

o Metoda Ornstein'a - Davis'a

o ruchliwość elektroforetyczna jest uzależniona od ładunku i rozmiaru cząsteczki 0 układ nieciągły, niedenaturujący

•    Elektroforeza w warunkach denaturujących (SDS, mocznik) + reduktor (0-merkaptoetanol, DTT)

o Rozdział na zasadzie sita molekularnego 0 Metoda Laemmli'ego: bufor elektrodowy: Tris-glicyna 0 Metoda Shagerravona: bufor elektrodowy: Trls-tricyna o Jest możliwe wyznaczanie masy cząsteczkowej białka: