25163

-    sens transformacji tylko wtedy, gdy gen ulega ekspresji

•    należy przygotować odpowiednie promotory

•    część niekodująca

•    zbiera sygnały z zewnątrz (bodźce, hormony)

-    klonowanie genów organizmów wyższych, u drożdży lub Pmcaryota

•    promotor musi być zawsze! z komórki gospodarza

•    różne promotory w zależności od genu, o wysokiej ekspresji

np. galaktozydazy GALI - typowe dla drożdży fosfatazy PHO enolazony EN01

•    należy dopilnować żeby była niezmieniona ramka odczytu

-    ważna potranslacyjna obróbka w komórce gospodarza, bo t zapewnia odpowiednią konformację i aktywność

metody odczytywania genów:

PCR dobre tylko dla małych fragmentów (polimeraza się myli; do kilku tyś. nukeotydów)

-    problem z genami mozaikowymi

-    introny trzeba zlikwidować - dlatego izolację prowadzi się na matrycach mRNA IZOLACJA NA MATRYCACH mRNA

-    wyspecjalizowane komórki organizmów zwierzęcych produkują specjalne białko (np. w jajowodach ptaków)

-    mRNA to czynnik ekspresji genów jakiegoś białka, w pewnych komórkach dużo 1 typu mRNA ~ Temis i Baltimore - Nobel za odkrycie odwrotnej transkiyptazy

-    mRNA -> DNA (zgodnie z dogmatem biologii molekularnej)

pseudogen (bez intronów) wprowadzany do wektora, potem zrekombinowany z DNA biorcy

metoda „SHOT GUN” - strzał na ślepo

-    przypadkowa fragmentaryzacja DNA jądrowego na małe fragmenty, określonym enzymem (np. BamHl) wprowadza się do wektora, tu też działa enzym; tworzą się lepkie końce ( bo tniemy tym samym enzymem) i powstają rekombinanty

-    cały genom w różnych częściach wektora (bank genów, biblioteka genowa); liczne kopie

~ przechowywane w postaci klonów bakteryjnych

~ duża liczba transformantów z wektorem i określonym fragmentem DNA - miliony komórek w banku genów, różne metody przechowywania i przekazywania; lub też w postaci DNA w temp. -70°C

metoda PRZECIWCIAŁ

-    ekspresja genu, otrzymanie produktu (białko

-    przeciwciała - stwierdzenie, które komórk produkują dane białko

• identyfikacja produktów genu

metoda HYBRYDYZACJI

-    mały fragment DNA znakowany sondą molekularną, identyfikowany, znakowany P32 (małym fragmentem łapiemy duży fragment)

-    spacer po chromosomach - izolacja kolejnych fragmentów DNA zawierających dany gen

metoda komplementacji w komórkach gospodarza (defektywnej funkcji)

-    defektywny mutant drożdży, np. uszkodzenie oddychania

-    transformujemy mutanta strukturami fenotypu dzikiego

2