101650

Wady:

- brak możliwości przeprowadzenia in vivo

II    Lucyferaza (na wektorze pGL3-P)

Gen kodujący lucyferazę jest odp za bioluminescencję organizmów takich jak: bakterii Vibrio haryeyi (geny luxA i luxB), robaczka świętojańskiego Photinus pyralis (gen Pp Luc) jamochłona morskiego Renilla reniformis (gen Rr Luc).

Lucyferaza robaczka świętojańskiego w obecności jonów Mg²' i tlenu atmosferycznego 0₂ katalizuje wykorzystanie ATP i lucyferyny, powodując przejście lucyfeiyny w stan wzbudzenia (oksylucyferyna), a następnie w czasie jej powrotu do stanu podstawowego emitowane jest światło o długości fali 562nm.

Lucyferyna + ATP + Mg² +    — oksylucyferuna + AMP + Pi

Odczynnik Luc.Y: ATP

Odczynnik LucY: lucyferyna, koenzym A

Całkowita emisja światła jest wprost proporcjonalna do aktywności lucyferazy w badanej próbce i pozwala na oszacowanie aktywności transkrypcyjnej genu reporterowego.

Substrat (lucyferynę) można aplikować na kilka sposobów. Komórki można umieścić na kilka minut w roztworze substratu. Do tkanek i całych roślin substrat może być podawany przez korzenie, rośliny można spryskiwać r-rem substratu z dodatkiem łagodnego detergentu.

Sposoby oznaczania:

-    bioluminescencyjnie- emitowane fotony zliczane są przy pomocy lumenometru Zalety:

-    możliwość dokładnego pomiaru ilości wyemitowanych fotonów

-    wysoka czułość

-    brak endogennej aktywności

-    możliwość badania ekspresji genów w pojedynczych komórkach i w całych organizmach

-    szybki pomiar Wady:

-    niestabilne białko

-    krótki okres półtrwania w komórkach

III    RI^;P białko czerwonej fluorescencji (na wektorze TURBO)

Sposoby oznaczania:

-    mikroskopia fluorescencyjna: w celu identyfikacji transformantów stosuje się światło UV, kolonie zmodyfikowane będą świecić na czerwono

-    cytomctria przepływowa: po utrwaleniu 4% formaldehydem Zalety:

-    możliwość badania ekspresji w żywych komórkach

-    naturalna zdolność do fluorescencji

-    możliwość śledzenia innych białek w komórce Wady:

-    niski poziom fluorescencji

4. Zasada i techniki pomiarów luminometrycznych.

Luminometria- metoda, pozwalająca określić zawartość adenozyno- trifosforanów w badanym materiale. Podczas hydrolizy ATP do ADP i ortofosforanu lub do AMP i pirofosforanu uwalniana jest pewna ilość energii swobodnej, którą można zmierzyć, jako