7) GFP to białko pomocnicze-akceptor energii z aequoryny, reemityjace się w postaci zielonego świtła
Zastosowanie:
1) do śledzenia interakcji pomiędzy proteinami oraz lokalizacji białek w organizmie.
2) stosowany jest jako gen reporterowy w badaniach aktywności promotorów i poziomu ekspresji genów znajdujących się pod ich kontrolą.
3) do wizualizacji żywych komórek-brak artefaktów-pochodnych utrwalania i barwienia
4) ujawnianie organizmów chimeiycznych- wczesne etapy regeneracji
Zalety:
1) wizualizacja łatwa- pod wpływem światła UV fluoryzuje na zielono
2) Jest małe i może być doczepiane do innych białek co umożliwia monitorowanie ich zachowania w komórce.
3) Otrzymano sztuczne wersje tego białka świecące w innych kolorach, co pozwala na jednoczesne badanie różnych procesów
4) Jak wspomniano, fluorescencja GFP jest naturalną własnością tego białka, co więcej poprawne funkcjonowanie peptydu nie wymaga żadnych dodatkowych substratów ani kofaktorów.
5) Gen GFP ulega ekspresji w komórkach bakterii, drożdży, drosopłiili, roślin a także w komórkach ssaczych.
6) Ponadto GFP jest bardzo stabilny in vivo, nie powoduje żadnych skutków ubocznych,
7) fuzja z -N i -C końcami różnych białek przeprowadzana wewnątrz komórki nie prowadzi do utraty własności fluorescencyjnych
8) Gen GFP może być wprowadzony do organizmu i następnie do genomu po przez hodowle, i wstrzykniecie przez wektor wirusowy lub transformacje
9) prosty, makroskopowy screening żywych komórek, tkanek, całych roślin w UV
10) możliwość zastosowania a mikroskopie konfokalnym
11) przeżyciowe podbarwianie- np. jodkiem propidyny - ściany komórek meryste ma tycz nych
Ekspresja dzikiego GFP nie przebiega prawidłowo u roślin. Niezbędne modyfikacje:
1) usunięcie ukrytego intronu będącego przyczyną mis-splicingu w wyniku czego zostaje usunięte 80 nukleotydów
2) akumulacja GFP w nukleoplazmie- trudność w regeneracji roślin. Toksyczność GFP wynika z generacji wolnych rodników związanych z fluorescencją podczas wzrostu w świetle co prowadzi do uszkodzeń DNA. Dlatego są opracowywane metody do kierowania GFP do określonych przedziałów wewnątrzkomórkowych. Najlepiej do ER
3) otrzymuję się tesmostabilne mutanty
4) zmienia się właściwości spektralne- na przykład posiadanie podwójnego piku wzbudzenia.
Wykorzystuje się dwa głów ne typy wektorów bazujących na plazmidzie Ti: