101955

Efektywność primerów specyficzna dla gatunku.

(AT)n obfite u roślin (tri i tetranuleotydy z mniejszą częstotliwością).

(AC)n były szczególnie pomocne w badaniach pszenicy i ziemniaka.

PCR-SSCP:

Badanie polimorfizmu konformacji ssDNA (identyfikacja mutacji).

DNA amplifikowany (PCR), amplikony denaturowane do form ss (silna zasada, działanie formamidu, wysoka temp) i poddawane rozdziałowi w PA A (warunki niedenaturujące).

W wyniku wewnątrzniciowego parowania zasad ss DNA „zgina się” w trójwymiarową strukturę. Pojedyncze mci równej długości, ale różniące się sekwencją wykazują różnice w ruchliwości elektroforę tycznej.

Konsekwencja: po rozdziale widoczne są różnice w odległości pomiędzy nićmi DNA normalnego, a DNA zmutowanego.

Pojedyncze różnice w sekwencji, spowodowane mutacja punktową wywołują zróżnicowaną migrację i charakterystyczne położenie żelu poliakrylamidowym.

RAPD-PCR:

Losowa amplifikacja polimorficznego DNA, stosuje krótkie, arbitralnie dobrane dekametry jako startery, wydajnie hybrydyzują z matiycą w temperamrach niższych niż w klasycznym PCR.

Różnica- stosowanie jednego startera, te przyłączają się do odwróconych sekwencji powtarzalnych na obu niciach. Przyłączone w odpowiedniej orientacji i odległości generują produkty, których wielkość odpowiada odległości między sekwencjami komplementarnymi do starterów.

Detekcja amplikonów po rozdziale w żelach. Liczba i lokalizacja miejsc komplementarnych odmienna dla różnych gatunków.

Podstawa różnicowania blisko spokrewnionych gamnków (ocena genetycznego podobieństwa taksonów).

Polimorfizm- wynik mutacji w obrębie sekwencji komplementarnych wobec końca 3’ startera oraz drobnych delecji/ inercji między miejscami przyczepu oligonukleotydu (startera).

Wykorzystywanie metod analiz matematycznych (np. U PGM A) pozwala na graficzną ilustrację wyników uzyskanych w RAPD w postaci tzw dendrogramów (drzew filogenetycznych), przedstawiają one stopień wzajemnej homologii między analizowanymi gatunkami.

Wybrane techniki molekularne:

Etapy:

RFLP: trawienie restryk, hybrydyzacja Southern.

RAPD: amplifikacja z udziałem losowych starterów CAPS: PCR, trawienie restryk, prod amplifi.

AFLP: trawienie rystiyk, ligacja adapterów. PCR SSR: PCR ze starterami mikrosatelit

Rodzaj polimorfizmu:

RFLP: mutacje punktowe, delecje, insercje RAPD: mutacje punktów, delecje insercje CAPS:

AFLP: -„-

SSn zmiana liczby powtórceń

Ilość DNA do testu:

RFLP: 5-10mg RAPD: 10-20ng CAPS: 50-100ng AFLP: 50-1 OOng SSR: 50-1 OOng

Typ sondy:

RFLP: gatunkowo specyf, genomowy o małej 1 kopi lub cDNA