slajd 2-3/30

1. Błony komórkowe:

• plazmolemma

• system endomembran - otaczają kompartymenty komórkowe (organelle),

tworzą sieć dzielącą cytoplazmę na izolowane obszary

błony spełniają dwie sprzeczne funkcje:

• zapewniają izolację (by zachować specyficzny metabolizm kompartymentu lub komórki)

• zapewniają komunikację (kontrolowaną)

dlatego muszą zawierać zarówno elementy nieprzepuszczalne jak i odpowiedzialne za wymianę informacji (dwukierunkowy transport substancji, odbieranie bodźców i umożliwienie adaptacji)

2 frakcje: lipidy - uporządkowana dwuwarstwa (szczelna bariera)

białka błonowe - decydują o specyficznej komunikacji

slajd 4-5/30

dwuwarstwa lipidowa:

• lipidy - 3 klasy:

• fosfolipidy

• część hydrofilna: glicerol + reszta kwasu fosforanowe, który może być zestryfikowany z różnymi podstawnikami

• fosfatydylocholina PC

• kwas fosfatydylowy

• fosfatydyloetanolamina PE

• fosfatydyloseryna PS

• fosfatydyloglicerol PG

• fosfatydyloinozytol - decyduje o przekazywaniu sygnałów (transdukcja

sygnalna)

• dużo w plazmolemmie

• galaktolipidy (galaktozyloglicerydy)

• część hydrofilna: glicerol + cukier (1-kilka) galaktoza

• monogalaktolipidy

• digalaktolipidy

• brak w plazmolemmie

• błony tylakoidów

• błona zewnętrzna plastydów

• błony komórek prokariotycznych

• sfingolipidy (glukocerebrozydy)

• część hydrofilna: sfingozyna + glukoza

• sfinganina

• ceramid

• glukozyloceramid

• plazmolemma: funkcje regulatorowe (przepuszczalność błony), aktywność białek enzymatycznych budujących błonę

częścią hydrofobową są kwasy tłuszczowe - nasycone i nienasycone

stopień nasycenia jest ważny dla warstwy lipidowej

bardziej nasycone - większa płynność (podwójne wiązanie powoduje zgięcie łańcucha i odsuwanie od siebie cząsteczek

• sterole

• część hydrofilna: -OH

• część hydrofobowa: cykliczne końce, różne w różnych związkach

najczęściej w błonach:

• cholesterol

• sitosterol

• stigmosterol

• kamposterol

slajd 6/30

Dzięki amfipatycznemu charakterowi lipidy w środowisku wodnym tworzą dwuwarstwę, spontanicznie zamykającą się w pęcherzyki (tak jest energetycznie korzystniej).

Ta właściwość jest wykorzystywana do tworzenia liposomów niosących różne substancje w medycynie, kosmetyce, biotechnologii.

Płynność błony zależy od stopnia nasycenia i długości kwasów tłuszczowych.

slajd 7/30

Ruchy lipidów:

• rotacja (najczęściej)

• fleksja - odchylanie się łańcuchów węglowych i powrót

• flip-flop - „przeskakiwanie” z jednej warstwy lipidowej do drugiej

• lateralna dyfuzja - przemieszczanie się w obrębie jednej warstwy

• bobbing - wyskakiwanie nad powierzchnię warstwy lipidowej

slajd 8/30

Asymetria dwuwarstwy lipidowej - nierównowaga rozmieszczenia lipidów:

1. glikolipidy - warstwa kontaktująca się ze środowiskiem zewnętrznym, często odpowiadają za asocjację z innymi komórkami lub organizmami

2. fosfatydyloinozytol - duża ilość po wewnętrznej stronie; odpowiada za przekazywanie informacji

slajd 9/30

Względna przepuszczalność sztucznej dwuwarstwy lipidowej:

• małe cząsteczki hydrofobowe (O₂, CO₂, N₂, benzen) - dyfundują

• małe cząsteczki polarne bez ładunku (H₂O, glicerol, etanol) - dyfuzja zgodnie z gradientem stężeń, dużo wolniejsza niż cząstek hydrofobowych (zbyt wolne przenikanie wody, by zaopatrzyć komórkę)

• większe cząsteczki polarne bez ładunku i jony - dwuwarstwa nie jest dla nich przepuszczalna. (jony otaczają się otoczkami hydratacyjnymi o wielkości odwrotnie proporcjonalnej do wartościowości i wprost proporcjonalnie do średnicy jonu; są zbyt duże, by przenikać)

slajd 10/30

białka błonowe

• integralne - przecinają błonę, wystają z obu stron, trudno je wyizolować

• peryferyczne - związane z błoną na zewnętrznej bądź wewnętrznej powierzchni

(w plazmolemmie to często glikoproteiny, dzięki którym zachodzi asocjacja z innymi błonami)

slajd 11/30

inny podział białek (ze względu na funkcje):

• transporterowe - wymiana substancji

• łączące - asocjują po jednej lub drugiej stronie błony z innymi białkami, nadając błonie sztywność

• receptorowe - percepcja bodźców, indukcja odpowiedzi wewnątrzkomórkowej (często to białka o konformacji enzymatycznej lub współpracujące z innymi białkami)

• enzymatyczne - zazwyczaj centrum katalityczne po wewnętrznej stronie błony (po zewnętrznej - syntaza celulozowa, która syntetyzuje ścianę komórkową)

białka istotne funkcjonalnie są integralne!

slajd 12/30

Struktura części transmembranowej białek integralnych:

• zazwyczaj α-helisa

• hydrofobowe łańcuchy boczne aa stykają się z łańcuchami kwasów tłuszczowych

• części hydrofilowe łańcucha polipeptydowego skierowane są do wnętrza α-helisy, tworzą mostki wodorowe

• kilka regularnie ułożonych helis może utworzyć hydrofilowy por wodny

slajd 13/30

1. Transport substancji:

Może się odbywać na dwa sposoby - biernie i aktywnie. Sposób przenoszenia zależy od gradientu stężenia i ładunku. W oba rodzaje transportu zaangażowane są inne białka.

1. Transport bierny

• spontaniczny

• zgodny z gradientem stężeń (do niższego)

• na drodze dyfuzji prostej lub ułatwionej (w ułatwionej uczestniczą białka błonowe - kanały lub przenośniki)

slajd 14/30

• cząsteczki obojętne - siłą napędową w ich transporcie jest gradient potencjału chemicznego substancji; transport trwa do momentu wyrównania potencjału

• cząsteczki naładowane - siłą napędową jest gradient potencjału elektrochemicznego substancji oraz potencjał transbłonowy

Potencjał transbłonowy wynika z rozmieszczenia ładunków po obu stronach błony - plazmolemma jest zawsze naładowana dodatnio po stronie apoplastu, dzięki działalności pomp protonowych

pH ściany = ok. 5; pH cytoplazmy = ok. 7

transport kationów jest ułatwiony („idą do minusa”); jest dużo większy niż bez potencjału transmembranowego

pH wakuoli jest niższe niż cytoplazmy

transport kationów jest utrudniony („idą do plusa”); wymaga nakładów energii

transport anionów - odwrotnie: ułatwiony z cytoplazmy do wakuoli, utrudniony z apoplastu do cytoplazmy

slajd 15/30

Transportery bierne - 2 typy: (dyfuzja ułatwiona)

• kanały białkowe:

bardzo często struktura podjednostkowa (najczęściej 2)

tworzą zwartą strukturę beczki z porem hydrofilowym

regulacja kanałów przez komórkę - zmiana stanu otwarcia kanału (2 stany konformacyjne - otwarty i zamknięty)

mechanizmy otwierania są różne, kanały otwierają się w odpowiedzi na:

1. zmianę potencjału błony (depolaryzacja i hiperpolaryzacja)

2. związanie liganda po stronie zewnętrznej lub wewnętrznej

np. pochodzące z rozkładu fosfatydyloinozytolu

jony wapniowe

hormony roślinne

3. stymulację mechaniczną (naprężenia błony) - skomplikowana transdukcja sygnału

• białka przenośnikowe:

przenoszą substancje na skutek zmian konformacyjnych indukowanych związaniem substratu

zmienia się powinowactwo do przenoszonej substancji:

1 stan konformacyjny - wysokie powinowactwo, następuje związanie substratu w bardzo konkretnym miejscu i zmiana konformacji - „otwarcie” po drugiej stronie błony

↓

2 stan konformacyjny - niskie powinowactwo, uwalnianie substratu

uniport - bierny transport jednej substancji w jednym kierunku

specyficzność kanałów i przenośników:

• specyficzne - przepuszczalne tylko dla jednego rodzaju cząsteczek:

• jonu - kanały potasowe (w szczególnych warunkach mogą transportować także Na⁺ - kiedy jego stężenie jest dużo większe niż K⁺)

• glukozy

• mniej specyficzne

• dla wszystkich jonów jednowartościowych lub dwuwartościowych

• dla wszystkich heksoz

kanały zarezerwowane są dla jonów, przenośniki dla innych substancji

slajd 16/30

2. Transport aktywny

• wbrew gradientowi stężeń lub potencjału elektrochemicznego

• wymaga nakładu energii (wiązań chemicznych, gł. ATP; świetlnej - u roślin nie!)

2 grupy:

Transportery pierwotne - do przeniesienia cząsteczki wykorzystują energię świetlną bądź chemiczną pochodzącą z rozkładu wiązań fosforanowych (hydrolizują ATP)

Transportery wtórne - wykorzystują pierwotną siłę protomotoryczną wytworzoną przez pompy protonowe (gradient protonów po obu stronach błony)

slajd 17/30

Transportery pierwotne:

• typu ABC

• Ca²⁺ ATPazy

• pompy protonowe

posiadają różną lokalizację subkomórkową i budowę;

kodowane są przez geny niespokrewnione

slajd 18/30

1. Transportery typu ABC

• kom. zwierzęce: w błonach zewnętrznych i endomembranach

• kom. roślinne:

• przez dłuższy czas sądzono, że występują tylko w tonoplaście i odpowiadają za jednokierunkowy transport cytoplazmawnętrze wakuoli

• znaleziono białko w plazmolemmie, które transportuje z cytoplazmy na zewnątrz

• transportery typu ABC są odpowiedzialne za detoksykację, transportują związki toksyczne:

• substancje obce dla komórki (ksenobiotyki)

metale ciężkie

herbicydy

• wtórne metabolity (produkty wtórnej przemiany materii)

produkty rozkładu chlorofilu

flawonoidy

antocyjany

• są bardzo podobne pod względem struktury:

• 1 łańcuch

• penetruje błonę przynajmniej 8 razy

• tworzy w dwuwarstwie

• α-helisy układają się w strukturę beczułki

• posiadają konserwatywne sekwencje wiążące nukleotydy (NBF1 i NBF2) w pętlach po stronie cytoplazmatycznej

• transportują substancje jako koniugaty glutationowe (przenoszone związki łączą się z glutationem Glu-Cys-Gly)

• do transportu substancji wykorzystywana jest energia z rozkładu wiązania fosforanowego w ATP

slajd 19-21/30

2. Ca²⁺ATPazy

• odpowiadają za aktywny transport jonów wapnia

• wysoka specyficzność

• należą do P-ATPaz (cechą wspólną tej klasy jest wrażliwość na wanadan oraz tworzenie ufosforylowanych intermediatów)

• budowa:

• pojedynczy łańcuch polipeptydowy przechodzący w poprzek błony 6-10x

• poszczególne Ca²⁺ATPazy różnią się nieco budową

• C-koniec krótki, nie ma charakteru regulatorowego

• N-koniec (pompy wapniowej tonoplastu) długi, koniec regulatorowy - posiada domenę wiążącą kalmodulinę

• kalmodulina - białko decydujące o aktywności transportera, bez niego nie zachodzi hydroliza ATP i transport jonów Ca²⁺

• lokalizacja:

• obficie w systemie endomembran (ER, tonoplast, wewnętrzna i zewnętrzna błona chloroplastu)

mniej w plazmolemmie

• centra katalityczne (odpowiadające za hydrolizę ATP) są eksponowane do cytoplazmy transport Ca²⁺ zawsze w jednym kierunku: z cytoplazmy (do wakuoli lub do apoplastu)

• uwaga! Ca²⁺ATPazy nie zaopatrują komórek w wapń (to robią kanały wapniowe - transport bierny). Odpowiadają natomiast za wyrzucanie Ca²⁺ (ważny element transdukcji sygnałów, czyli przekazywania bodźców)

slajd 22/30

3. Pompy protonowe

hydrolizę ATP wykorzystują do kierunkowego przeniesienia protonu

1. pompy plazmolemmy

• tylko jeden rodzaj - plazmolemmowa H⁺ATPaza

• budowa:

• pojedynczy polipeptyd (ok. 100kDa)

• posiada 8-10 transmembranowych α-helis

• po stronie cytoplazmatycznej znajdują się oba końce oraz 2 małe i 2 duże pętle

• duża, wysoce konserwatywna pętla zawiera centrum wiążące ATP

• druga duża to pętla transdukcyjna, sprzęga hydrolizę ATP z transportem H⁺

• mała pętla pomiędzy 2 i 3 helisą ulega fosforylacji tworząc ufosforylowane intermediaty

• N-koniec krótki

• C-koniec hydrofilny, stanowi domenę autoinhibitorową (reguluje aktywność pompy protonowej)

slajd 23/30

• autoregulacja pompy:

• C-koniec nieufosforylowany - łączy się z centrum katalitycznym, pompa nieaktywna

• fosforylacja reszty serynowej C-końca za pomocą kinazy serynowo-treoninowej (przenosi fosforan z ATP na aminokwas)

do ufosforylowanego ogona przyłącza się białko z grupy 14-3-3 (białka stare ewolucyjnie, duża homologia, regulują także inne procesy metabolizmu podstawowego)

C-koniec zostaje odciągnięty, następuje aktywacja ATPazy

• podobny efekt do fosforylacji seryny daje przyłączenie do C-końca fuzikokcyny (toksyny grzybowej)

stabilizuje ona kompleks białka 14-3-3 z łańcuchem polipeptydowym, stymuluje ciągłe działanie ATPazy

cel grzybów: spadek pH ściany komórkowej rośliny rozrywanie mostków wodorowych rozluźnienie struktury ściany łatwiejsza inwazja strzępek

• funkcja: kierunkowy transport protonów z cytoplazmy do ściany komórkowej

• we włośnikach: produkcja gradientu potencjału elektrochemicznego na błonie, czyli pierwotnej siły protomotorycznej, która może być wykorzystywana do aktywnego przemieszczania substancji przez transportery wtórne (pobieranie substancji mineralnych z podłoża)

• indukcja wzrostu zakwaszanie ściany powoduje jej rozluźnienie - I etap wzrostu elongacyjnego

• w błonach komórek szparkowych napędzanie transportu substancji osmotycznie czynnych do/z komórek szparkowych (decydują one o stanie otwarcia aparatu, co reguluje bierne pobieranie wody i natężenie fotosyntezy)

slajd 24/30

2. pompy protonowe tonoplastu

• V-ATPaza

• należy do klasy FC-ATPaz (występują one także w błonie tylakoidowej i wewnętrznej błonie mitochondrialnej - tam synteza ATP, w tonoplaście hydroliza)

• składa się z 2 sektorów: V₁ i V₀

• V₁ - tzw. główka, sektor hydrofilny, wystający z błony po stronie cytoplazmatycznej, składa się z:

• podjednostki A (x 3) - funkcja katalityczna, tu hydroliza ATP

• podjednostki B (x 3) - funkcja regulatorowa, decyduje o natężeniu hydrolizy

• podjednostki C, E, G, H - wchodzą w skład części statorowej, odpowiadającej za prawidłową konformację białka

• podjednostki D i F - tworzą trzonek, sprzęgający oba sektory - część katalityczną i transdukcyjną

• V₀ - integralny sektor błonowy

• podjednostka a - stator, utrzymuje konformację

• podjednostki c (x 6) - tworzą kanał protonowy

• podjednostka d - asocjuje z trzonkiem

• energia z hydrolizy ATP służy do przeniesienia H⁺ z cytoplazmy do wakuoli przez sektor V₀

• pirofosfataza

• 1 łańcuch polipeptydowy

• 14 transmembranowych α-helis tworzących kanał protonowy

• sekwencja DVGADLVGKVE - miejsca wiązania i hydrolizy ATP

• długa domena katalityczna, konserwatywne segmenty CS1, CS2, CS3

• transport protonów z cytoplazmy do wakuoli

slajd 25/30

pompy protonowe plazmolemmy i tonoplastu generują gradient elektrochemiczny błony, stanowiący tzw. pierwotną siłę protomotoryczną (pmf), wykorzystywaną przez transportery wtórne do przenoszenia substancji przez błony

wszystkie pompy protonowe utrzymują względnie stałe pH cytoplazmy (ok. 7), by inne enzymy mogły prawidłowo funkcjonować (pH o innej wartości krótko - to sygnał dla komórki)

dlaczego w tonoplaście są aż 2 pompy protonowe?

V-ATPaza jest bardzo wrażliwa, jej aktywność momentalnie spada w obecności toksyn. Wtedy za generowanie gradientu potencjału chemicznego odpowiada pirofosfataza

slajd 26/30

Transportery wtórne:

Jest ich znacznie więcej niż pomp protonowych.

Przenoszą związki zawsze wbrew gradientowi stężenia.

Duża specyficzność substratowa.

Mogą transportować związki na zasadzie:

• symportu: transport substancji do komórki jednocześnie z protonem

• antyportu: transport substancji w przeciwnym kierunku niż protonu (proton do środka, substancja na zewnątrz komórki)

slajd 27/30

Z uwagi na powinowactwo do substratu transportery wtórne dzielą się na:

• transportery wysokiego powinowactwa HATS (High Affinity Transport System)

• zaopatrują rośliny w substancje odżywcze występujące w środowisku w bardzo niskim stężeniu (<1μmol)

• transportery niskiego powinowactwa LATS (Low Affinity Transport System)

• zaopatrują rośliny w makro- i mikroelementy, występujące w dużych stężeniach (5-10 μmol)

/takie stężenia są rzadko spotykane, dlatego tych transporterów jest w komórce mniej niż HATS/

• odpowiadają za rozładunek ksylemu (transport daleki - z naczyń do komórek mezofilu)

• odpowiadają za dystrybucję pierwiastków w różnych częściach rośliny

Transportery wtórne mogą mieć charakter białek:

• konstytucyjnych (ciągła ekspresja genów kodujących, są zawsze w komórce)

• indukcyjnych (ekspresja genów indukowana substratem)

slajd 28/30

Transportery wysokiego powinowactwa HATS:

HKT1 - potasowy 8-12(16)x penetrują dwuwarstwę jako α-helisy

HPT1 - fosforanowy specyficzne sekwencje aminokwasów po stronie

HST1 - siarczanowy cytoplazmatycznej rozpoznają substrat

regulacja potranslacyjna - fosforylacja

Transportery indukcyjne: siarczanowe, fosforanowe.

transdukcja sygnału

pierwiastek w środowisku ekspresja genu kodującego transporter

slajd 29/30

Transportery bierne i aktywne ( pierwotne i wtórne ) w plazmolemmie:

• 1 pompa protonowa (forma nieaktywna/aktywna)

• kanały potasowe (odpowiedzialne za influx i eflux), wapniowe i dla innych jonów

• wtórne - wszystkie mają charakter symporterów:

• głównie anionowe

• wyjątek: potas wzrost stężenia w komórce (ochrona przed utratą wody lub jej akumulacja), tym transporterem mogą także do komórki napływać jony sodu

• transportery cukrów i aminokwasów - szersze spektrum specyficzności substratowej

slajd 30/30

Transportery pierwotne i wtórne tonoplastu:

• pierwotne:

• ABC-transportery

• V-ATPaza

• pirofosfataza

• wtórne:

• kationowe (antyportery, jeżeli transport wakuolacytoplazma)

• anionowe

• przenoszące aminokwasy

WYKŁAD: TRANSPORT SUBSTANCJI PRZEZ BŁONY KOMÓRKOWE - 8 -

- 8 -

---